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甲状旁腺激素PTH是含有84个氨基酸的一条多肽链分子,分子量为9.5kDa。在人体中由甲状旁腺主细胞产生。调节人体钙、磷代谢及骨转换。近年医学研究表明,PTH可用于治疗临床上的骨质疏松,是有很好的疗效且没有副作用的肽类激素用药,并且可以作为甲状腺功能低下的替代用药。重组人PTH1-84国内未有产品上市,本文的研究内容是利用基因工程的技术合成和纯化重组人甲状旁腺激素PTH1-84。本文的内容包括下面几个部分:(1)融合蛋白表达质粒的构建通过PCR技术改造PTH1-84 DNA片段,改造为原核偏好的PTH1-84片段,扩增获得DNA片段,构建含有PTH1-84基因片段的重组质粒pET32a。(2)PTH的原核表达将带有PTH1-84基因的重组质粒pET32a转化入大肠杆菌感受态细胞中.表达重组融合蛋白。通过对培养时间,IPTG浓度的调整,确定了最终的培养过程为:将氨苄筛选的菌落接种于液体培养基,过夜振荡培养,将菌液按1:50的比例转接到含氨苄的LB培养基中,培养至OD值为0.6时,最后加入IPTG进行诱导,IPTG浓度为1mM,继续培养3小时后离心收集菌体。(3)PTH的纯化菌体经细胞破碎仪冰浴破碎离心提取上清液、镍离子亲和层析、肠激酶酶切、SP强阳离子交换层析、source15rpc反相层析最终得到纯化的PTH1-84蛋白。经SDS-PAGE电泳及RP—HPLC的分析,与天然pth1-84的分子量一致,纯度能达到95%以上,免疫荧光检测发现其具有良好的免疫原性。本实验使用各种基因工程技术及纯化技术手段。成功地将PTH1-84基因转入PET32a质粒,并转化入大肠杆菌进行融合蛋白的表达,在经过条件优化后,融合蛋白的含量能达到210.34mg/L培养基,目标蛋白占总蛋白的30%以上。经亲和层析纯化后产生重组的完整PTH。经过SDS-PAGE电泳和免疫荧光表明,本实验提纯的PTH1-84与天然的甲状旁腺激素分子量一致。