miRNA(microRNA)是新发现的一类在动植物细胞中广泛表达的小分子非编码RNA(nocoding RNA, ncRNA)分子。通过调控基因的表达,miRNA在生物的生命过程中起着非常重要的作用,即广泛参与机体生长、发育、疾病发生等各种生命过程。近年来从多种生物体中已经鉴定出了数千种miRNA,但只有少数miRNA的靶基因及功能被研究清楚,大部分miRNA在细胞中所起的作用对我们来说还是一个有待揭示的谜。miRNA是通过调控靶基因的表达发挥作用的,因此miRNA靶基因的筛选与鉴定对miRNA的功能研究至关重要。此外,作为一种可调控基因表达的内源性分子,miRNA在肿瘤的基因治疗中具有许多独特的优势。本研究运用RNAi及基因芯片技术进行了miRNA靶基因的规模筛选,并对获得验证的结果进行了深入分析,同时还初步探讨了miRNA技术用于肿瘤基因治疗的可能性。成熟miRNA不是由基因直接转录产生,而是先生成较长的pri-miRNA,在细胞核内由Drosha和DGCR8蛋白复合体加工生成有发夹结构的pre-miRNA。pre-miRNA转运到细胞质后,由Dicer加工生成成熟的miRNA。可见,Drosha是miRNA加工过程中一个非常重要的蛋白。当Drosha表达被抑制,miRNA的加工途径将受到破坏,而成熟miRNA的表达水平则相应迅速下调。因此,受miRNA调控的靶mRNA的表达水平也会相应发生改变。基于此,本研究利用RANi技术抑制Drosha表达并筛选出Drosha表达下调的稳定细胞株;基因芯片在全基因组范围上分析Drosha表达下调的稳定细胞株中差异表达的基因,获得众多受miRNA调控的候选靶mRNA;运用生物信息学技术反向预测候选靶基因的调控miRNA,并用荧光素酶报告基因等技术对预测结果进行了验证;对于证实的miRNA-mRNA靶向调控关系,深入分析了它们在细胞活动过程中的作用。本部分获得的主要研究进展有:1、筛选获得了系列miRNA候选靶基因:筛选建立了Drosha表达下调的稳定细胞模型;对Drosha表达下调的稳定细胞模型进行基因芯片分析,获得了Cyclin D1、P21等众多有重要功能的差异表达基因,这些基因即为miRNA的候选靶基因,这为大规模miRNA功能研究奠定了基础;2、miR-16家族可调控Cyclin D1的表达:根据上述结果,我们运用生物信息学技术对调控Cyclin D1表达的miRNA进行了反向预测,结合报告基因技术及Western blottng,我们发现miR-16、miR-195及miR-424等miR-16家族的miRNA可调控Cyclin D1的表达,并诱导细胞周期G1期阻滞;3、miR-16家族可通过调控Cyclin D1(CCND1)、Cyclin D3(CCND3)、Cyclin E1(CCNE1)及CDK6等细胞周期相关基因的表达诱导G1期阻滞:深入分析发现Cyclin D1、Cyclin D2、Cyclin D3、Cyclin E1及CDK6等直接调控细胞G1/S期转换的基因均含miR-16的调控位点,而报告基因技术及Western blotting分析结果显示Cyclin D1、Cyclin D3、Cyclin E1及CDK6确实受到miR-16的调控。这表明miR16家族通过靶向协同调控这些细胞周期相关基因的表达诱导细胞G1期阻滞从而参与调控肿瘤细胞周期进程。肿瘤的发生发展受到多个基因的调控,单靶点基因治疗策略在临床上存在很大的局限,而多靶点联合策略对于肿瘤的基因治疗在理论上更有优势。根据内源miRNA特异性调控基因表达的原理,人工miRNA也逐渐被用于靶向抑制基因的表达。我们基于内源miRNA的结构框架设计并构建了pEGFP-miR-vector载体,该载体可在表达蛋白的同时,还可在基因3’非编码区表达针对任意基因设计的miRNA从而抑制相应基因的表达。我们利用pEGFP-miR-vector同时抑制survivin并过表达apoptin进而对双基因联合策略在抑制肿瘤生长中的作用进行研究。本部分获得的主要进展包括:1、pEGFP-miR-survivin载体可显著抑制survivin基因的表达:根据miR-155的结构特征构建了pEGFP-miR-vector载体。设计针对survivin的干扰序列,构建到pEGFP-miR-vector上,转染细胞后发现,survivin的表达显著下调;2、双基因联合策略具有更好的诱导肿瘤细胞凋亡及抑制细胞增殖效果:利用人工miRNA表达载体实现了survivin干扰RNA及apoptin基因的共表达,并发现同时过表达apoptin和抑制survivin的双基因联合策略抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的效果均强于单独过表达apoptin或抑制survivin。这一结果表明基于内源miRNA的人工miRNA载体在肿瘤的联合基因治疗中具有潜在的应用价值。总之,本研究避开传统的研究思路寻找特定miRNA的靶基因,通过mRNA芯片检测Drosha表达下调的稳定细胞模型中差异表达的基因,获得众多受miRNA调控的候选靶基因;反向筛选这些候选靶基因的调控miRNA发现,miR16家族通过协调调控CCND1等多个细胞周期相关基因参与肿瘤细胞周期进程的调控。此外,我们还发现基于人工miRNA同时过表达apoptin和抑制survivin的双基因联合策略对肿瘤细胞生长的抑制具有协同效应。这些研究工作为大规模研究miRNA在细胞增殖和癌变中的重要作用以及它们在肿瘤基因治疗中的应用奠定了良好的基础。