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第一部分miR-424-5p在结直肠癌组织中的表达及其临床特征分析目的:通过TCGA数据库分析在结直肠癌和正常结直肠组织中差异的miRNAs,并通过我院样本证实miR-424-5p在结直肠癌组织中的表达差异。进一步分析miR-424-5p的表达及其与临床病理特征之间的关系。方法:1.登录TCGA数据库网站（https://cancergenome.nih.gov）下载619例结直肠癌组织和21例正常结直肠组织的基因测序数据和临床资料,获得包括miRNA测序数据通过R语言Edge R包进行分析并构建差异表达的miRNAs基因热图。2.收集2016年7月-2018年3月河北医科大学第一医院普通外科（胃肠外科）59例手术切除的结直肠癌组织及对应的癌旁正常组织标本（距肿瘤组织边缘5cm以上的正常结、直肠粘膜组织）。3.利用Trizol提取结直肠癌组织和癌旁正常组织中总RNA,在通过反转录获得c DNA,最后通过实时定量荧光PCR测定miR-424-5p的表达水平。并以U6为内参,用2-△CT计算方法分析miR-424-5p在结直肠癌组织中的相对表达水平。4.采用统计软件SPSS 21.0对数据进行分析。两组之间比较使用Mann Whitney检验,其中P<0.05为差异有统计学意义。非正态分布的数据以P50（P25,P75）表示,正态分布的数据以均数±标准差表示。结果:1.miR-424-5p在TCGA数据库结直肠癌样本癌组织中的表达水平高于正常组织。2.RT-q PCR法分析了我院59例结直肠癌组织及其配对癌旁正常组织中miR-424-5p表达水平。结果显示,miR-424-5p在结直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织,这一结果与TCGA数据库中miR-424-5p表达情况一致。3.miR-424-5p在结直肠癌样本中的表达水平与临床病理特征密切相关。结果显示,miR-424-5p在结直肠癌中的表达水平Dukes分期C,D期[32.450（5.696,117.800）]的癌组织高于Dukes分期A,B期[2.695（1.518,43.650）]的癌组织（P=0.0159）;T3,T4期[33.650（2.191,117.400）]的癌组织高于T1,T2期[3.770（1.470,14.670）]的癌组织（P=0.045）;在结直肠癌腺癌[12.380（1.905,170.100）]中的表达水平亦高于粘液癌[4.848（1.641,26.720）]中的表达水平（P=0.0451）。而miR-424-5p表达与结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤部位、有无远处转移、肿瘤分化程度无显著相关性。结论:miR-424-5p在结直肠癌组织中相对于正常结直肠粘膜组织高表达,并且与结直肠癌组织的Dukes分期、T分期和病理类型有关。第二部分miR-424-5p在人结直肠癌细胞中的功能研究目的:研究miR-424-5p在SW480结直肠癌细胞中发挥的各项生物学功能,初步探讨miR-424-5p在结直肠癌发生发展中潜在的作用机制。方法:1.利用lipofectamine 2000将miR-424-5p mimic、mimic control和miR-424-5p inhibitor、inhibitor control分别转染入结肠癌（SW480）细胞内,48h后Trizol法提取RNA,RT-q PCR法测定miR-424-5p的相对表达量。2.细胞转染模拟物或抑制物后,应用CCK-8试剂盒,分别于24h、48h、72h、96h测定OD值,根据OD值进一步绘制细胞生长曲线;应用细胞克隆实验,检测10-14天细胞克隆形成数目。根据上述两种实验的结果分析细胞增殖状态,探讨miR-424-5p对结直肠癌细胞增殖的影响。3.细胞转染模拟物或抑制物后,应用细胞划痕修复实验、迁移和侵袭小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力,探讨miR-424-5p对结直肠癌细胞转移的影响。结果:1.转染miR-424-5p mimics 48h后SW480细胞miR-424-5p的表达情况相对于对照组均有明显的上调,平均上调倍数为22倍,转染miR-424-5p inhibitors 48h后SW480细胞miR-424-5p的表达情况相对于对照组均有明显的下调,平均下调倍数为-10.5倍,（P<0.05）。说明:miR-424-5p mimics和inhibitors已经成功地转染。2.转染24h、48h、72h、96h后,miR-424-5p mimics、miR-424-5p inhibitor实验组和对照组在各个时间点的OD值,利用OD值计算增值率。结直肠癌细胞中的miR-424-5p水平升高,能对结直肠癌细胞的增殖起到较好的促进作用。然而结直肠癌细胞中的miR-424-5p水平减低,能对结直肠癌细胞的增殖起到较好的抑制作用。平板克隆形成实验也同样表明,和阴性对照组相比,miR-424-5p过表达可显著促进SW480细胞的集落形成能力,SW480细胞中的miR-424-5p显著降低后抑制细胞的集落形成能力。3.细胞划痕和迁移实验结果显示,和阴性对照组相比,过表miRNA-424-5p使SW480细胞数迁移能力增强,miR-424-5p促进了SW480细胞迁移能力,然而和对照组相比抑制miR-424-5p使SW480细胞数迁移能力减弱。Transwell侵袭小室实验同样表明,和阴性对照组相比,过表达miR-424-5p使每个高倍镜视野下SW480细胞数明显增多,miRNA-4 24-5p过表达明显促进了SW480细胞侵袭能力。侵袭小室实验结果显示,和阴性对照组相比,抑制miR-424-5p使每个高倍镜视野下SW480细胞数明显减少,抑制miR-424-5p表达明显抑制了SW480细胞侵袭能力。结论:miR-424-5p在结直肠癌细胞中发挥促癌作用,过表达miR-424-5p可以促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。敲低miR-424-5p可以抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。第三部分在人结直肠癌细胞中miR-424-5p发挥功能的分子机制目的:利用转录组测序和生物信息学基因富集分析方法,筛选出miR-424-5p的所有靶基因和发挥作用的信号通路,为全面阐明miR-424-5p的作用机制提供可靠依据。方法:1.利用lipofectamine 2000将miR-424-5p mimic、mimic control和miR-424-5p inhibitor、inhibitor control分别转染入SW480细胞内,48h后提取总RNA。2.利用转录组测序,筛选差异表达的基因,通过R语言的ggplot程序绘制差异表达基因（DEG）火山图,并联合生物信息学基因富集分析方法进行功能注释、GO分析和通路富集（KEGG）分析。3.为进一步研究预测miR-424-5p的作用靶基因,对miR-424-5p mimic作用后下调的靶基因和Target Scan预测miR-424-5p的靶基因进行维恩图分析。结果:1.miR-424-5p mimic（实验组）及miR-424-5p mimic control测序后得出实验组和对照组的差异基因（DEGs）2302个,其中1322个为表达上调基因,980个为表达下调基因。2.GO富集分析结果表明,DEGs被显著富集在丝氨酸水解酶活性、丝氨酸型肽酶、内肽酶、鸟苷三磷酸酶、PDZ结构域结合、生长因子活性等生物学过程;并且DEGs还富集在结肠疾病等多种疾病相关簇中相关。3.KEGG通路富集结果表明,下调的DEGs显著富集于:Wnt（Wnt signaling pathway）信号通路,其下游标记基因有WNT6,WNT11,DVL1,Ra C3,FZD9,SFRP5 and FZD2;血管内皮生长因子（VEGF signaling pathway）信号通路,TGF-beta信号通路等;上调的DEGs显著富集于:MAPK（signaling pathway）信号通路,胰岛素信号通路（insulin signaling pathway）等。4.下调的差异基因和Target Scan预测miR-424-5p的靶基因的维恩图结果表明交集基因共30个。结论:miR-424-5p在结直肠癌中发挥功能的潜在机制是通过调控Wnt信号传导通路、血管内皮生长因子信号通路和TGF-beta信号通路、MAPK signaling pathway信号通路等多信号传导通路实现的。