目的探寻Na+/K+-ATPase在Bufalin（蟾毒灵）抑制肝癌细胞生长过程中所发挥的作用及相关机制。方法1.WST-8（water-soluble terazoliun salt）法测定Bufalin对人肝癌细胞株PLC/PRF/5、HepG2、SMMC7721肿瘤抑制作用,并绘制细胞生长抑制曲线。2.采用RT-PCR及Western Blot技术,检测人肝癌细胞株PLC/PRF/5、HepG2、SMMC7721中Na⁺/K⁺-ATPaseα亚基表达差异。3.采用Stealth RNAi方法,对Na⁺/K⁺-ATPaseα3 isoform高表达株PLC/PRF/5进行进行干扰。4.WST-8法测定人肝癌细胞株PLC/PRF/5及Na⁺/K⁺-ATPaseα3 isoformRNAi后的PLC/PRF/5细胞株对Bufalin敏感性的变化。结果1.HepG2、PLC/PRF/5/、SMMC7721在应用Bufalin后均出现生长抑制现象,但三株细胞对Bufalin的敏感性有较大的差异,HepG2、PLC/PRF/5/、SMMC7721应用Bufalin 24小时的IC₅₀分别为182.3nM,52.2nM,97.74nM。体外抑瘤曲线表明在以上三株肝癌细胞中PLC/PRF/5对Bufalin最为敏感,而HepG2最不敏感。2.Na⁺/K+-ATPaseα1,Na⁺/K⁺-ATPaseα2,Na⁺/K⁺-ATPaseα3,Na⁺/K⁺-ATPaseα4在人肝癌细胞HepG2,PLC/PRF/5,SMMC7721中均有表达,但含量存在差异。以GAPDH为参照,HepG2,PLC/PRF/5,SMMC7721中的Na⁺/K⁺-ATPaseα1的mRNA相对表达量分别为2.78,1.76,1.72;Na⁺/K⁺-ATPaseα2中的mRNA相对表达量分别为1.28,0.92,0.84;Na⁺/K⁺-ATPaseα3中的mRNA相对表达量分别为0.45,1.79,0.88;Na⁺/K⁺-ATPaseα4中的mRNA相对表达量分别为0.79,0.64,0.47,通过以Na⁺/K⁺-ATPaseα异构体的在各肝癌细胞的相对表达量为X轴,三株肝癌细胞各自的IC₅₀为Y轴作图,可以发现Bufalin的抑制肝癌的能力与Na⁺/K⁺-ATPaseα3的表达呈正相关。3.应用Western Blot检测在肝癌细胞中Na⁺/K⁺-ATPaseαmRNA表达量较高的的两种亚型Na⁺/K⁺-ATPaseα1及Na⁺/K⁺-ATPaseα3,结果显示以GAPDH为参照,HepG2、PLC/PRF/5、SMMC7721中的Na⁺/K⁺-ATPaseα1的蛋白相对表达量分别为:1.86,1.46,1.64;Na+/K+-ATPase a3蛋白相对表达量分别为:1.73,2.94,1.914.应用Stealth RNAi技术对Na⁺/K⁺-ATPaseα3干扰后,通过RT-PCR检测,发现,siRNA1、siRNA2、siRNA3的RNA表达水平分别为空白对照组的41.8%,10.5%及74.1%;我们选择siRNA2作为阳性干扰序列进行后续研究。5.通过WST-8技术检测Na⁺/K+-ATPaseα3被干扰后肝癌细胞对Bufalin敏感性的变化,显示Na⁺/K⁺-ATPaseα3被干扰后的肝癌细胞对Bufalin的敏感性明显下降,应用Bufalin 48小时后,PLC/PRF/5/RNAi组的IC₅₀为42.10nM,阴性对照组（lipofect）的IC₅₀为29.29nM;HepG2/RNAi组的IC₅₀为200.10 nM,阴性对照组（lipofect）的IC₅₀为84.53 nM。结论1.Bufalin能有效抑制肝癌细胞生长。2.Bufalin抑制肝癌细胞生长的能力与肝癌细胞中Na⁺/K⁺-ATPaseα3的表达水平成正相关,Na⁺/K⁺-ATPaseα3被干扰后,Bufalin抑制肝癌细胞生长的能力下降,Na⁺/K⁺-ATPaseα3可能是Bufalin抑制肝癌细胞生长的一个重要靶点。3.Na⁺/K⁺-ATPaseα3在肝癌细胞差异性表达可导致肝癌细胞对Bufalin反应性的差异,通过对肝癌中的Na⁺/K⁺-ATPaseα3检测能一定程度预测肝癌对以Bufalin为主要活性成分的抗肿瘤药物对治疗的反应,也有利于筛选出Bufalin为主要活性成分的抗肿瘤药物的优势人群。