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目的: 用人蛔虫体腔液(Ascaris body fluid,ABF)干预体外培养的人肺腺癌细胞株A549,探讨ABF对A549细胞分泌IL—6、TGF—β的影响,即ABF浓度和作用时间与IL—6、TGF—β分泌水平的关系,以及ABF影响下靶细胞IL—6、TGF—β分泌与细胞凋亡的关系。 方法: 1.绘制A549细胞生长曲线:取对数生长期的A549细胞常规消化计数,准确将细胞分别接种于24孔培养板中,每日取3孔计数,连续观察7天。掌握靶细胞基本生长规律。 2.ABF制备:对蛔虫感染者一次口服双羟萘酸噻嘧啶(30mg/Kg体重),服药后从粪便中收集蛔虫成虫。取完整的蛔虫,经自来水、无菌生理盐水洗净后,滤纸吸干,持镊子夹住前端,使之垂直于消毒离心管上,在虫体末端剪一小口,体液自然流出,逐条收集。收集的液体在10,000×g离心30分钟,取上清,经0.45μm醋酸纤维膜过滤除菌,用核酸蛋白仪测蛋白含量为3370μg/ml,置-30℃储藏备用。 3.细胞毒性实验:取对数生长期的A549细胞常规消化计数,准确将细胞分别接种于96孔培养板中,将起始浓度为3370μg/ml的ABF倍比稀释至13.5μg/ml,用MTT法检测细胞活性,取细胞存活率大于50%的ABF浓度为诱导实验的浓度范围。 4.细胞干预实验:依据细胞毒性实验的结果,将干预物ABF以10μg/ml、100μg/ml、300μg/ml三个浓度作用A549细胞,在干预1h,3h,5h,9h后收取各时间段不同作用浓度的细胞培养上清,用ELISA法检测IL—6、TGF—β表达水平。同时收取细胞进行HE染色,观察细胞凋亡情况,采用HE染色盲法计数计算细胞凋亡率。 5.DNA琼脂糖凝胶电泳:取浓度100μg/ml的ABF作用A549细胞为实验