菊芋耐寒、耐旱能力强,繁殖快,根块产量高,病虫害少,可充分利用荒地、盐碱地、荒漠地区种植,不仅不占用耕地良田,而且能够改善土壤和治理土地荒漠化。菊芋在我国各地区广泛存在,块茎中富含菊粉,可以利用微生物发酵或酶解等生物转化的方法来生产高附加值的高果糖浆、低聚果糖、其它发酵制品和生物燃料等产品。β-键连接的低聚果糖(Inulooligosaccharides,IOS)是功能性低聚糖,在食品、医药等方面具有极大的应用价值,具有难消化性、食物纤维的作用、低龋齿性、促进双歧杆菌的增殖、改善脂质代谢作用等优越性,适合现代人们对食品安全性、健康性及功能性等需求的特点,逐渐成为菊粉生物转化应用极其重要的方向。低聚果糖的生产方法主要有两种:一种是以蔗糖为原料利用呋喃果糖苷转移酶(Frucofranosidase)作用来制备,该方法的缺点是反应产物中生成大量的葡萄糖,通常占到35%以上,去除难度大,导致其生产成本的增加;另一种方法是以菊粉为原料利用微生物生产的内切型菊粉酶酶解制备低聚果糖,该方法的优点是只需一步酶解就可以生成80%以上的高纯度低聚果糖,产物中的葡萄糖含量极低,又由于菊粉的来源丰富,价格便宜,使得该方法具有非常广阔的应用前景。用菊粉酶法生产低聚果糖的工艺,对微生物具有较高要求,首先微生物所产的酶液中只能有内切型菊粉酶,而不能有外切酶及转移酶的存在;第二是微生物所产酶液中菊粉酶的酶活力要高、稳定性要好。因此,获得优良的产菊粉内切酶微生物是工业以菊粉生产低聚果糖的关键。然而自然界中,微生物所产的菊粉酶既含有内切酶也含有外切酶,通过基因重组技术,将菊粉内切酶基因克隆表达在稳定的表达系统中,从而获得单一的菊粉内切酶。本研究从无花果曲霉ATCC16882菌株中克隆了菊粉内切酶inu2基因,插入pPIC9K质粒,转入毕赤酵母GS115中,通过抗生素G418的筛选重组子,用实时荧光定量PCR方法确定了重组子拷贝数分别为1、2、3、5的菊粉内切酶INU2重组毕赤酵母菌株INU2-1、INU2-2、INU2-3、INU2-5,并对多拷贝重组子进行甲醇诱导发酵,发现多拷贝重组子比单拷贝的inu2产量高,在摇瓶培养下,3拷贝、5拷贝转化子的产酶量相当,最高菊粉酶酶活达到570 U/ml。对3拷贝转化子INU2-3进行3 L发酵罐高密度补料诱导发酵,甲醇诱导7天后,发酵上清液中的菊粉内切酶酶活达到了 2190 U/ml。构建了 3拷贝inu2表达盒重组质粒pGAPZα A-3INU2,并将该质粒电转到INU2-3重组菌株上,获得了转化子,通过实时荧光定量PCR实验,确定整合进了 2拷贝的GAP组成型inu2表达盒,对这株拥有5拷贝的双启动子重组菌株INU2-A3-G2进行3 L发酵罐的高密度补料诱导发酵,甲醇诱导204小时后酶活达到了 3006 U/ml,是目前文献报道最高酶活的2.2倍。重组INU2粗酶液作用于底物菊粉,对产物进行薄层层析,结果表明INU2彻底酶解菊粉的终产物中,单糖占有12.4%,二糖占有10.6%,而三糖占了 77.0%,可以用于低聚果糖的生产。对发酵粗酶液进行硫酸铵盐析研究结果表明,当pH为4,硫酸铵饱和度为50%,重组蛋白的盐析效果最好,盐析效率达到65.4%。对INU2酶液保护剂进行了研究,获得复合保护剂最佳配方为CaCl2 15 mmol/L、蔗糖40%、山梨醇50%,保护效果良好,可以用于酶制剂的生产保存。