论文部分内容阅读
慢性乙型肝炎是全球性问题。有研究表明,肝癌的发生与持续性肝损伤和慢性炎症密切相关。其中,90%的肝细胞癌发生与慢性炎症有关。研究慢性炎症诱发的肝细胞癌至关重要。本实验室前期研究发现,在乙肝患者的肝脏中热休克蛋白gp96的表达水平明显高于正常人,但gp96上调表达的机制以及gp96的高表达在肝细胞癌发生过程中的作用尚不清楚,需要进一步的研究。核转录因子κB(NF-κB)作为重要慢性炎症活化通路在慢性乙型肝炎诱发的肝细胞癌中起重要作用。本文首先运用Real-time PCR和Western blot检测瞬转NF-κB亚基p65的真核表达载体后细胞内gp96的mRNA和蛋白水平,结果显示mRNA和蛋白水平显著上调。接着对gp96启动子序列进行生物信息学分析,运用在线预测软件分析发现gp96启动子上存在NF-κB结合位点,构建双荧光素酶活性报告系统,并对启动子上NF-κB结合位点定点突变,瞬时共转NF-κ B亚基p65和启动子突变结合位点突变表达载体,结果显示该位点突变后,NF-κB不能激活gp96启动子,证明NF-κB通过与该位点结合激活gp96的转录进而上调蛋白水平。进一步研究gp96高表达对肝细胞癌发生的作用。通过瞬转gp96真核表达载体和RNA干扰技术来过表达或者敲低细胞内gp96蛋白水平,使用CCK-8法和流式细胞术检测细胞的增殖、细胞周期和凋亡情况,结果显示gp96高表达后肝细胞增殖加快、凋亡减少,细胞周期从静息期向分裂期的转化增多,敲低后得到相反结果,证明gp96具有促进肝细胞增殖、抑制凋亡,促进细胞周期从静息期向分裂期的转化的作用。同时,在过表达gp96后,Western blot检测细胞EMT转化指标,RNA干扰技术敲低gp96,通过单克隆形成实验检测细胞转化水平,结果显示gp96促进肝细胞EMT发生和细胞集落的形成,初步证明gp96高表达后会诱发正常肝细胞向癌细胞转变。综上所述,我们研究发现NF-κ B通过与gp96启动子上结合位点结合,激活gp96转录,进而上调gp96表达。高表达的gp96具有促进肝细胞增殖、抑制凋亡,促进细胞周期从静息期向分裂期的转化的作用,同时促进肝细胞EMT发生和细胞集落的形成,这为揭示NF-K B通路在HBV感染引起的慢性炎症诱发肝细胞癌的发生中作用提供了一种可能性,同时也为临床上开发gp96作为治疗肝细胞癌靶点提供了依据。