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目的尘肺是当前危害我国职业人群最严重的一类职业病,由于发病机制仍不完全清楚,给尘肺的防治带来了很大的困难,因此,探讨尘肺的发生机制,认识发病发生的早期事件及其规律,对尘肺的防治具有十分重要的意义。体外及动物实验资料表明,细胞凋亡(尤其是肺泡巨噬细胞凋亡)是尘肺发生发展的免疫病理学基础。细胞凋亡主要由三条信号转导途径介导:一是线粒体途径,二是内质网途径,三是膜死亡受体途径;膜死亡受体主要包括:Fas/FasL(Fas ligand)途径、肿瘤坏死因子受体(Tumor necrosis factor receptor,TNFR)/肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor receptor alpha,TNF-α)途径、肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体受体(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptor, TRAILR)/肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)途径。关于Fas/FasL途径和TNFR/TNF-α途径介导的细胞凋亡与尘肺发生之间联系的研究已有报道,而关于TRAILR/TRAIL途径介导的细胞凋亡与肺纤维化发生之间联系的研究尚未见报道,因此,我们的研究重点探讨TRAILR/TRAIL途径介导的AM凋亡与煤工尘肺( coal workers’pneumoconiosis,CWP)之间的联系。本研究通过对接触煤尘及煤矽尘的观察对象和CWP患者肺灌洗液中AM的离体培养,在抑制TNFR/TNF和Fas/FasL两条信号转导途径的基础上,采用不同抑制剂在信号通路的不同环节阻断TRAIL/TRAILR信号转导后,研究AM的凋亡情况及各种凋亡信号蛋白的表达情况,探讨TRAILR/TRAIL途径介导的AM凋亡在CWP发生发展中的作用机制,为CWP的早期防治提供依据。对象与方法以中国煤矿工人北戴河疗养院进行大容量肺灌洗治疗的,接触煤尘及煤矽尘的44例汉族男性CWP患者为研究对象,以24例接触煤尘或煤矽尘的观察对象为对照进行研究。根据研究内容设计调查表,调查内容包括研究对象的一般情况、职业史、接尘史、疾病史等,尘肺的诊断以研究对象所在地的尘肺诊断组的诊断结论为依据(GBZ70-2009),尘肺并发症的资料来自中国煤矿工人北戴河疗养院专科医院的住院病案。由研究生本人采用面对面访谈式问卷调查。实验室研究研究对象在全身麻醉状态下行大容量双肺同期灌洗手术,取适量的支气管肺泡灌洗回收液,用三层无菌纱布过滤,离心,弃去上清,用高压灭菌的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤AM三次,离心弃上清,加适量DMEM培养基制成细胞悬液,取少量细胞悬液,稀释适当的倍数后进行细胞计数。每例研究对象的细胞分为六个处理:A组(未处理组)、B组(SOD组)、C组(TRAIL/TRAILR组)、D组(抗-TRAIL抗体组)、E组(Caspase-8抑制组)、F组(NF-κB抑制组)。用六孔培养板进行细胞培养,先纯化培养2h,贴壁细胞即为纯化的AM,重新更换2ml新鲜的培养基,各组添加相应试剂后继续培养24h。收获AM,用普通光镜,激光共聚焦显微镜,透射电镜,流式细胞术观察AM凋亡检测情况,采用Western blot(WB)检测死亡信号蛋白TRAILR2(DR5)、caspase-8和caspase-3的表达情况。所有资料经整理后用Excel建库,采用SPSS13.0统计分析软件处理数据,多组均数间的比较采用方差分析或秩和检验,多组率的比较采用χ2检验。结果1 CWP凋亡信号蛋白的表达水平以及粉尘暴露因素对AM凋亡信号蛋白表达水平的影响研究发现,壹期和贰期CWP患者DR5,caspase-3和caspase-8的表达水平均高于观察对象;接尘工龄≥20年的CWP DR5,caspase-3和caspase-8的表达水平高于接尘工龄<20年组(P<0.05);发病工龄<10年CWP DR5和caspase-3的表达量高于发病工龄≥10年组(P<0.05);发病年龄<40岁CWP caspase-3的表达量高于发病年龄≥40岁组(P<0.05)。2 CWP患者AM凋亡情况普通光学显微镜、透射电子显微镜、激光共聚焦显微镜下均可观察到AM凋亡的典型形态:染色质边缘化、新月体形成、细胞核碎裂成块状。流式直方图上可看到在正常二倍体峰(Go/G1)前出现典型的亚二倍体凋亡峰。定量分析表明,CWP患者AM的凋亡指数高于观察对象,差异具有统计学意义(P<0.05);贰期CWP患者AM的凋亡指数高于壹期CWP患者,差异具有统计学差异。凋亡指数与凋亡蛋白的表达水平呈正相关,差异具有统计学意义(P<0.05)。3不同抑制剂对CWP患者AM凋亡的影响本研究发现在CWP中,SOD组和TRAIL /TRAILR组AM的凋亡指数低于未处理组,差异具有统计学意义(P<0.05);抗TRAIL抗体组,caspase-8抑制剂组和NF-κB抑制剂组AM的凋亡指数均低于TRAIL/TRAILR组,差异具有统计学意义(P<0.05)。4不同抑制剂对TRAIL/TRAILR信号通路中DR5,caspase-3,caspase-8表达的影响研究发现,SOD组DR5,caspase-3和caspase-8的表达水平均低于未处理组和TRAIIL/TRAILR组,差异具有统计学意义(P<0.05)。抗-TRAIL抗体组caspase-3和caspase-8的表达水平低于未处理组和TRAIL/TRAILR组,差异有统计学意义(P<0.05);抗-TRAIL抗体组DR5的表达水平低于未处理组,差异有统计学意义(P<0.05); caspase-8抑制剂组caspase-3和caspase-8的表达水平均低于未处理组和TRAIL/TRAILR组,差异具有统计学意义(P<0.05);caspase-8抑制剂组DR5的表达水平低于未处理组(P<0.05);NF-κB抑制剂组caspase-3和caspase-8的表达水平低于未处理组和TRAIL/TRAILR组,差异具有统计学意义(P<0.05);NF-KB抑制剂组DR5的表达水平低于未处理组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1 TRAIL/TRAILR信号转导途径中各凋亡蛋白DR5、Caspase-8、Caspase-3均有一定程度的表达。凋亡信号蛋白的表达水平随着工龄,发病工龄,发病年龄的增加而有所升高。2 CWP患者AM存在过度凋亡。CWP患者AM的凋亡指数高于观察对象,凋亡指数随着肺纤维化程度的加重而升高。SOD复合酶,抗-TRAIL抗体,caspase-8抑制剂及NF-κB抑制剂均能抑制AM凋亡。3在TRAIL/TRAILR信号转导途径中,SOD对上游蛋白DR5,下游蛋白Caspase-8、Caspase-3的表达均起到抑制作用,抗-TRAIL抗体可抑制下游蛋白Caspase-8、Caspase-3的表达,Caspase-8抑制剂可抑制其下游Caspase-3和caspase-8的表达。