便秘的危害是渐进的,不易引起医生及患者重视,但长期顽固性便秘对人体的危害是不容忽视的。人们普遍的惯性思维认为便秘仅仅是大便干硬难出,事实上便秘与许多疾病的发生发展密切相关。随着饮食结构的改变及精神心理和社会因素的影响,便秘已严重影响了现代人的生活质量;且在结肠癌、肝性脑病、乳腺疾病、早老性痴呆等疾病的发生中有重要作用;在急性心肌梗死、脑血管意外等症时便秘可导致生命意外;便秘和部分肛肠疾病有密切的关系,如痔、肛裂等。因此,早期预防和合理治疗便秘将会大大减轻便秘带来的严重后果和社会负担。随着现代生活水平的提高,人们对生活质量的期望越来越高,对于既往常被忽视的一些功能性疾病更加重视。生活方式的改变、饮食结构的变化使得便秘发病率逐渐升高,尤以老年及经产女性居多。流行病学资料显示,从美国的几个全国性调查数据中得出美国便秘的发病率为3%,即大约有4百万美国人患有便秘,每年有3-4百万人应用泻剂辅助排便,且便秘患病率随年龄的增大而增加。我国的流行病学资料显示,我国发生率10%～15%左右,60岁以上的老年人占发病人群的18%～23%.治疗便秘的药物较多,但大多难收持久疗效,且长期应用易导致药物依赖及副作用发生机率增加。祖国医学对于便秘的治疗积累了丰富的经验,认为功能性便秘有虚实之分,临床发现顽固性便秘以实秘为主,发病年龄趋于年轻化。导师周建华教授经多年实践,参详古今,在内治法治疗便秘取得初步成效的基础上,研发外治法,弥补长期服用泻剂带来的副作用。功能性便秘之所以疗效不尽如人意,因为现代医学对便秘的病因、发病机制尚未完全清楚。研究者们在不断进行着有益的探索,认为功能性便秘患者存在结肠动力紊乱,结肠平滑肌病变,结肠神经丛及神经递质异常,结肠粘膜水通道蛋白表达异常。尽管如此,仍不能完全阐释便秘的发病机制。随着对ICC研究的深入,其在胃肠动力障碍性疾病中作用越来越受到重视。便秘是临床常见疾病,也是多种疾病常见的症状之一,可分为原发性便秘和继发性便秘。本研究的内容即指原发性功能性便,目的在于研究便秘贴治疗功能性便秘之实秘的治疗机制。原发性性功能性便秘治疗困难,需长期反复用药,长期反复应用泻剂,可加重肠壁损害,导致便秘症状更加顽固。促动力药物因可导致恶性心血管事件,亦为临床少用。周建华教授总结多年内治法治疗功能性性便秘的经验,自创外治法(便秘贴)治疗功能性便秘,临床疗效满意。周师勤求古训,汇通中西,并结合自已多年临床实践,对便秘一症有独到认识。便秘贴是周教授多年临床经验的结晶,在其领导的肛肠科疗区已广为应用。为进一步验证便秘贴治疗功能性便秘实秘的临床疗效,探讨治疗机理并结合当前国内外研究进展特设计本课题。本课题主要从以下2个方面进行研究:第一部分临床研究目的:验证便秘贴治疗功能性便秘实秘的临床疗效。方法:本实验研究收集入选病例80例,随机分成2组,治疗组40例,对照组40例。治疗组给予便秘贴,对照组则选用麻仁软胶囊口服(麻仁软胶囊有效成分与便秘贴有效成分接近,治疗方向一致)。疗程2周,对比两组经药物干预后的症状积分变化情况,从而进一步证明便秘贴的疗效更显著。结果:经秩和检验,组间总体疗效比较P=0.01<0.05,有显著性差异,故治疗组疗效明显优于对照组。组间痊愈与显效率经卡方检验比较P=0.002<0.05,说明便秘贴治疗实秘型便秘消除或改善临床症状的程度高于麻仁软胶囊。经多个独立样本比较的秩和检验,治疗组与对照组疗前与疗后7天中医证候积分比较,P=0.106>0.05,无统计学差异。疗前与疗后中医证候积分比较P=0.000<0.05,具有统计学显著性差异,说明便秘贴治疗实秘降低中医证候积分明显优于麻仁软胶囊,且随访发现应用便秘贴患者,一般感觉良好,无大便溏泻、腹部不适等副作用。第二部分实验研究实验一:实秘型功能性便秘小鼠模型复制目的:复制实秘型功能性便秘小鼠模型方法:实验方法参照王朝辉、彭志辉、齐微[10]等文献方法,造模组及各拟用药物组小鼠皮下注射盐酸吗啡,2.5mg/(kg·d),共45天,空白组注射等体积等渗盐水共45天。造模组及各拟用药物组小鼠禁水不禁食,每日给予等量大米,连续72小时,这样就形成了实秘型便秘的模型。在造模期间注意观察每只小鼠的一般体征变化情况;记载小鼠的日平均粪便称重测定:即7天测一次24小时粪便重量,同时收集各代谢笼中实验小鼠的粪便重量,待实验结束后,计算出每组小鼠日平均粪便称重,最后进行统计学分析。结果:空白组小鼠:精力充沛,神态正常,行动矫健,神气依常,动作敏捷;皮毛密实,光泽亮丽,紧贴皮肤;眼睛明亮,眼珠色泽粉红光亮;口鼻唇处清洁而湿润,色泽淡粉红;腰脊背平直无弯曲,活动自如不受限,觅食及饮水正常。造模组小鼠禁水不禁食72小时后表现出精神亢奋,轻度烦躁,体重略减轻,稍有竖毛,活动少,腹部略胀满,尿色深黄量少,鼻唇失泽发干,大便干结呈圆珠状,或串珠状等症状,符合便秘实秘的临床特征。实验二:便秘贴对实秘型便秘模型小鼠结肠cajal间质细胞的影响目的:探讨便秘贴对功能性便秘的机理方法:各药物组分别按动物体表面积换算法计算剂量,灌服各组小鼠,每日1次,持续两周。便秘贴成糊状,常温以lOg/kg/d涂抹于脱毛处,麻仁软胶囊组给予麻仁软胶囊0.25g/kg/d,莫沙必利组给予莫沙必利3.0mg/kg/d。模型组及空白组不予任何药物,两组灌服等体积量生理盐水,每日1次,持续两周。最后1次给药后,拉椎处死动物,解剖小鼠腹腔,分离大肠,各组小鼠结肠组织肉眼观察未见差异,切取距离肛门约lcm远端结肠肠段2段,用无菌盐水冲洗干净,分别置于福尔马林液中固定及液氮罐中冷冻保存待用。采用免疫组化技术及激光共聚焦显微镜扫描观察各组小鼠结肠Cajal间质细胞(Interstitial cells of Cajal ICC)的变化。结果:表明慢性功能性便秘模型小鼠存在结肠ICC的异常,便秘模型小鼠结肠ICC数量明显减少,并有形态异常,与空白组小鼠比较ICC连接网络欠完整。便秘贴使用14天后小鼠结肠ICC数量有明显升高。西药莫沙必利对便秘模型小鼠结肠ICC有一定影响,但未见统计学差异,麻仁软胶囊能够提高ICC数量,但与便秘贴比较存在明显差异。便秘贴有效成分能够明显增加便秘模型小鼠结肠ICC的数量,且对ICC数量的影响存在量效关系,便秘贴对ICC数量的改善更加明显,几乎接近空白组小鼠结肠ICC的数量。便秘贴疗效更加明显。推测便秘贴治疗便秘的机理是通过ICC完成的。实验三:便秘贴对实秘模型小鼠结肠c-kit蛋白表达的影响目的:本研究拟从检测便秘贴中有效成分干预后的便秘模型小鼠结肠组织c-kit蛋白表达情况入手,探讨便秘贴作用机理,从而在分子水平来阐释其通便机制。方法:取液氮冷冻保存的便秘模型小鼠结肠组织,利用western-blot技术检测便秘贴干预后的便秘模型小鼠结肠组织c-kit蛋白表达的变化。结果:经聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸纤维素膜蛋白质印迹显示出一条145KD的条带,符合c-kit蛋白的分子量大小。模型组该蛋白表达明显降低,便秘贴组蛋白表达与模型组比较有显著提高。经方差分析,模型组与空白组比较P<0.01,具有显著统计学差异,说明模型组小鼠结肠c-kit蛋白表达明显下调,存在表达异常。