研究背景：周围神经损伤是骨科创伤中的常见病多发病,占四肢创伤总数的12.5%。而其中神经离断或严重挫伤、挫灭需手术治疗的病例又在1/2以上。目前周围神经离断的主要治疗手段主要有神经直接修复的手术和神经移植与桥接类手术。前者主要包括神经外膜缝合术、神经束膜缝合术、神经束膜外膜联合缝合术、粘合剂粘合神经、激光修复等。后者主要包括自体神经移植术、异体神经移植术、神经转移术、神经端侧吻合术、生物移植体桥接(骨骼肌、生物膜管、基膜管、几丁质管等)和非生物移植体桥接(硅胶管、碳纤维管)等。对于神经移植与桥接类手术,由于自体神经移植术和神经转移术需牺牲供取神经功能、异体神经移植术存在免疫排斥反应、非生物移植体桥接遗留异物需二次手术取出而生物移植体桥接则大多处于动物实验阶段,所以此类手术仅限于神经有大段缺损或挫灭时尝试选择应用。对于所见到的大多数周围神经离断的病例,目前临床上采用最多的方法仍然是神经直接修复的方法,陆裕朴等认为一般2cm以内的缺损可以通过适当游离后牵拉而弥补,牵拉延长神经的15%～25%,而后可以进行直接吻合。但是,直接修复的方法由于存在以下缺点和不足仍然效果不够理想。(1)吻合口容易与周围组织发生粘连,形成局部压迫影响神经功能的恢复。(2)纤维组织侵入吻合口内形成疤痕,阻碍再生的神经纤维通过吻合口长入神经远端。(3)局部缺乏富含促进神经纤维再生与成长的各种生长因子的微环境,难以形成有利于神经纤维再生的“再生室”效应。(4)生长受阻的再生神经纤维可以在局部形成神经纤维瘤。因而,如何寻找一种能够避免或减少上述缺陷而又操作简单方便的周围神经修复方法是目前骨科临床亟待解决的重要课题。神经损伤修复是多种因素综合作用的复杂过程。研究证明吻合口周围的微环境是决定周围神经再生与生长的决定因素,许多细胞因子在神经再生过程中起重要作用,研究证明能促进神经再生的因子主要有：转化生长因子(TGF-β)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)、肿瘤坏死因子(TNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)等。由于内源性因子的剂量通常不足以满足神经再生的需要,因此有必要加入外源性的再生促进因子。实验证明,通过这些因子的加入,能明显促进神经的再生。其中神经生长因子(NGF)是最早发现和最肯定的细胞因子。高延明等探讨了NGF局部连续给药对周围神经损伤后的修复与再生的影响。结果表明,NGF局部连续给药具有明显的促进周围神经损伤后的修复与再生作用；且NGF局部连续给药优于局部单次给药。但由于这些因子是具有生物活性的多肽或蛋白质,在体内极易变性失活,如何在保持活性下进行控制释放也是一个引起人们极大兴趣的课题。本人先期的研究将神经生长因子加入到生物蛋白胶的有形成分内,使神经生长因子在生物蛋白胶配制过程中自然地融于其中,由于二者都是有活性的生物分子,具有相同的生存环境,不发生化学反应,因而形成了一种含有神经生长因子的生物蛋白胶,将含有NGF的生物蛋白胶包埋大鼠坐骨神经吻合口并进行：观察伤肢功能恢复情况及坐骨神经功能指数；神经电生理测定坐骨神经传导速度和小腿三头肌动作电位峰值；形态学观察吻合口粘连情况及神经纤维瘤生成情况；吻合口切片光镜及电镜观察再生神经纤维数量,再生神经纤维通过率和纤维组织侵入情况及再生神经纤维及轴突的直径、结构和髓鞘厚度。结果显示实验组以上各指标均明显优于对照组。作者近年来临床应用本方法治疗周围神经离断患者20余例取得了良好的治疗效果。但目前采用该种方法治疗周围神经损伤尚缺乏理论依据,需要从机制方面进行探讨。为此,作者设计了本课题研究。目的：采用免疫组化、RT-PCR和电镜等技术从细胞、分子生物学水平探讨FG-NGF胶膜在周围神经损伤的吻合口包埋修复周围神经生长的机制,为该治疗方法的有效性提供理论依据。方法：一、首先建立大鼠坐骨神经损伤后吻合口FG-NGF胶膜包埋的动物模型。选用Wistar大鼠,采用股骨后内侧切口,于坐骨神经分叉处上方约0.5cm处切断坐骨神经,在显微镜下吻合。配置含有神经生长因子的纤维蛋白胶,均匀喷洒于吻合口周围。分别于造模后第1,2,4,8周观察模型情况,同时设立坐骨神经损伤后单纯吻合组为对照组。二、观察大鼠坐骨神经吻合口FG-NGF胶膜包埋对脊髓运动神经元的影响。于造模后第2,4,8周多聚甲醛固定后取得实验组和对照组腰3至骶2节段的脊髓,冰冻切片,采用HE染色及尼氏染色,显微镜下观察脊髓神经元尼氏体、前角神经元等形态结构、数量的改变。三、研究FG-NGF胶膜包埋对大鼠坐骨神经吻合口雪旺氏细胞p75水平的影响。结合酶消化、培养、阿糖胞苷处理和S-100免疫荧光鉴定,取得吻合口的雪旺氏细胞,进行普通培养基和添加高浓度IL-1培养基的培养,检测不同时间点的雪旺氏细胞表面神经生长因子p75的表达情况。四、研究FG-NGF胶膜包埋对坐骨神经末端效应器官的影响。①在不同时间点沿坐骨神经走行方向分离至神经肌肉接头处,获取0.5×0.5cm的带有神经的新鲜肌肉组织,冰冻切片后AchE抗体免疫组化染色,光镜下观察运动终板的数量。②在不同时间点取神经进入肌肉部位连同神经一起用质量浓度为2.5%的戊二醛固定,光镜下取该部位组织小块,进行再固定、脱水、包埋、切片、染色,电镜下观察。结果：造模成功后实验组和对照组均在第2,4,8周取材比较,免疫组化染色显示,第2周时两组脊髓神经元均出现形态结构破坏,染色变浅,核固缩,细胞突起有的消失,其中对照组神经元结构破坏更剧。第4周,两组神经元破坏仍较严重,但实验组的神经胶质细胞增多,神经元的形态较对照组有所恢复,染色有所变深。第8周这两个时间点的对照组和实验组神经元的形态结构差异更大,实验组脊髓神经元形态趋于规则、完整,细胞突起趋于发达,尼氏体趋于丰富、染色更深,神经元排列趋于整齐。吻合口的雪旺氏细胞普通培养基和添加IL-1培养基培养后p75表达显示,第1周的实验组和对照组的雪旺氏细胞p75表达水平达到的高峰值较低,且两者的峰值相差不大,到达高峰值的时间较长,但无明显差异。而第2周的实验组雪旺氏细胞p75表达水平达到的高峰值较第1周有所增高,达到高峰值的时间较第1周稍有缩短。而第2周的对照组较第1周的峰值和出现峰值的时间变化不大。第4,8周的雪旺氏细胞p75表达水平的峰值较对照组明显变高,出现峰值的时间明显提前,两组具有显著性差异。光镜下观察见运动终板呈棕褐色“条状”结构,2周时,实验组和对照组均显示运动终板数量较少,终板染色较浅,形态多呈不规则状。在运动终板的数量上两组无明显差异。4w、8w时试验组运动终板数量进一步增多,染色加深,延肌纤维分布清晰,对照组运动终板数量增加,但较实验组少,且终板形态呈不规则状,染色较淡。两组存在着明显差异。电镜观察：2w时可见标本变性严重,未能找到神经肌肉接头。骨骼肌细胞核、肌原纤维、间质细胞退变严重,部分结构肿胀、溶解,成纤维细胞和大量纤维成分增生。实验组及对照组无明显差异。8w时可见少量神经肌肉接头,但数量较少,无法行统计学研究。骨骼肌和间质细胞内可见比较清楚及形态规整的细胞核及其他细胞器。胶原纤维、Z线结构及肌节等结构都比较清晰完整。但实验组内骨骼肌和间质细胞的数量、形态明显好于对照组,两组存在着显著性差异。结论：①FG-NGF胶膜能缓慢释放神经生长因子,并转运到达神经元胞体并维持神经元细胞的存活。②缓慢释放的神经生长因子通过与雪旺氏表面的p75受体结合而促进雪旺氏细胞的增殖与成熟,从而诱导神经轴突的生长和髓鞘的成熟。③缓慢释放的神经生长因子能够增加坐骨神经末端效应器官的形成和促进成熟。