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本研究制苗用毒株为猪伪狂犬病病毒HB2000株，是由猪伪狂犬病病毒鄂A株经基因敲除技术缺失TK、gE、gI基因部分核苷酸得到的TK-/gE-/gp63-突变株（gp63基因即gI基因），中和试验结果表明，HB2000株病毒能被PRV特异性血清中和；PCR结果证明，可扩增出特异性的748bp TK基因片段和514bp gE-gI基因片段，毒种特异性良好。应用响应面法（RSM），筛选并优化耐热保护剂配方，试验结果表明：谷氨酸钠、L-精氨酸盐酸盐和D-山梨醇能够显著提高病毒对冻干环境的耐受能力；酶解酪蛋白、海藻糖、明胶、蔗糖和牛血清白蛋白显著性依次递减；以冻干后病毒保护率为响应值，响应面优化出最佳配方为：谷氨酸钠2%、L-精氨酸盐酸盐2%、酶解酪蛋白7.6%、D-山梨醇2%、明胶4%、海藻糖1%、牛血清白蛋白2%、蔗糖15.2%。采用该配方进行验证实验，冻干保护率达到80.40%；耐老化试验中37℃保存7日及2~8℃保存24个月，病毒滴度下降分别为0.47、0.55、0.62及0.41、0.47、0.51，该配方制备的活疫苗热稳定性良好。依据冻存试验和共熔点测定结果，设计冷冻工艺参数，对冻干曲线优化，最终确定冻干曲线为：①产品预冻阶段：常温进箱，1h内将板层温度降至-42℃并维持3h；②升华干燥阶段：2h内将板层温度从-42℃升至0℃并维持15h；③解析干燥阶段：2h内将板层温度从0℃升至28℃并维持8h；④冻干结束，曲线全长约31h。该疫苗成乳白色海绵状疏松团块，5/5可见紫色辉光，剩余水分含量1.7%~2.2%，冻干存活率为88.73%，37℃保存7日病毒滴度下降未超过1个滴度，2~8℃保存期可达24个月，符合标准。疫苗安全和效力检验结果证明，对1日龄仔猪分别进行单剂量接种试验5/5安全、单剂量重复接种试验5/5安全、超剂量接种试验5/5安全，与空白对照仔猪无显著差异；本动物免疫攻毒试验中攻毒对照组5/5发病，疫苗接种组5/5保护。疫苗病毒含量与攻毒保护相关性研究结果证明，103.0TCID50接种组攻毒后0/5保护；104.0TCID50接种组攻毒后3/5保护；105.0TCID50和106.0TCID50攻毒后均4/5及以上保护；攻毒对照组5/5表现为持续高热、呼吸困难、神经症状等猪伪狂犬病典型临床症状。对怀孕母猪攻毒，攻毒对照组4/5发病，所产仔猪出现死胎、弱仔、木乃伊胎等症状，105.0TCID50接种组和106.0TCID50接种组均4/5及以上母猪得到保护，而104.0TCID50接种组只有2/5母猪得到保护。由此可见攻毒保护率随着疫苗病毒含量的增加而提高，疫苗病毒含量和攻毒保护具有正相关性，仔猪和母猪最小免疫剂量确定为105.0TCID50；中和抗体效价与攻毒保护呈正相关，当仔猪中和抗体效价大于等于1︰16时，可使100%的仔猪获得攻毒保护；当母猪中和抗体效价大于等于1︰12时，可使100%的母猪获得攻毒保护。达到同类进口产品的质量标准。