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风湿病(Rheumatism)是一组侵犯关节、骨骼、肌肉、血管及有关软组织或结缔组织为主的疾病,其中多数为自身免疫性疾病。潮汕地区中草药海滩牵牛,俗称白花马鞍藤,拉丁名:Ipomoea stolonifera(Ipomoea imperati(Vahl))(IS),人们用它祛湿通络,治疗风湿病,特别是类风湿性关节炎,有着悠长的历史和显著的疗效,民间常用来治疗炎症相关疾病。因此,对IS有效部位各单体抗炎作用以及各单体联用效应和机制的分析,为其临床疗效提供理论依据是十分有意义的。 本课题组前期研究,通过各种整体模型证明IS有效部位(EFIS)对急、慢性炎症均有良好的抗炎作用;通过检测巴豆油致小鼠耳肿胀部位MPO的活性,细胞因子IL-6、TNF-α、炎症介质NO、PGE2、LTB4的产生和释放,进一步揭示了EFIS的抗炎机制。有效部位经过进一步的分离鉴定,得到5种单体成分,分别为橙皮素(Hesperetin,H),秦皮乙素(Esculetin, E),伞形香豆素(Umbelliferone,U),姜黄素(Curcumin,C)以及东莨菪亭(Scopoletin, S)。前期研究发现, EFIS单体东莨菪亭和橙皮素合用后,小剂量情况下呈协同作用,大剂量则为拮抗作用。在此基础上,本实验研究5个单体成分的抗炎活性,联用后的配比剂量及其作用机制。选取巴豆油致小鼠耳肿胀和角叉菜胶致大鼠足肿胀两个急性炎症模型为指标,研究5个单体成分的抗炎作用和研究5个单体联用后的主要作用成分、最佳配比剂量;在细胞模型上检测各个单体对于炎性蛋白COX-2、5-LOX的蛋白表达水平影响和对MAPK通路的作用,探讨IS的抗炎机制。 方法: 1.观察5个单体对巴豆油致小鼠耳肿胀和角叉菜胶致大鼠足肿胀模型的抗炎活性; 2.利用均匀设计法研究5个单体联用对两个急性炎症模型的影响,得到主要作用成分和最佳配比剂量; 3.在脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7巨噬细胞模型中,用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测EFIS单体对COX-2、5-LOX、MAPKs家族成员ERK1/2和P38蛋白表达水平及ERK1/2和P38活性的影响。 结果: 1. EFIS中单体对巴豆油致小鼠耳肿胀及角叉菜胶致大鼠足肿胀都有显著的抑制作用,以东莨菪亭和姜黄素的作用最强; 2.5个单体联用在巴豆油致小鼠耳肿胀模型中,起主要作用的单体为东莨菪亭,姜黄素和伞形香豆素,最佳剂量配比为:H=600 mg/kg,E=500 mg/kg,U=1000 mg/kg, C=200 mg/kg,S=80 mg/kg;在角叉菜胶致大鼠足肿胀模型中,起主要作用的单体为东莨菪亭,姜黄素和伞形香豆素,最佳剂量配比为:H=355 mg/kg,E=440 mg/kg, U=700 mg/kg,C=265 mg/kg,S=40 mg/kg。 3. EFIS中各单体均能抑制LPS诱导的COX-2和5-LOX蛋白表达,以姜黄素和东莨菪亭作用最为显著;各单体均对LPS诱导的ERK1/2活性增加有抑制作用,对总ERK蛋白表达无作用;对p-P38蛋白表达有抑制作用。 结论: 1. EFIS5个有效单体橙皮素、秦皮乙素、伞形香豆素、姜黄素和东莨菪亭对巴豆油致小鼠耳肿胀及角叉菜胶致大鼠足肿胀两个急性炎症模型有不同程度的抑制作用,提示各单体均为有效成分,具有抗炎活性。 2. EFIS5个单体联用后在两个急性炎症模型中起主要作用的均为伞形香豆素、姜黄素和东莨菪亭;两个急性炎症模型中各单体的最佳配比剂量接近。即得到了EFIS治疗急性炎症稳定的物质基础和联用剂量。 3. EFIS单体抗炎作用可能是与抑制花生四烯酸代谢通路的两个限速酶COX-2和5-LOX的蛋白表达,调节MAPK家族成员ERK1/2和P38相关信号通路有关。