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抑郁发病率逐年增加,目前病因不明。研究证明环境内分泌干扰物(Environmental Endocrine Disruptors,EDCs)能通过血脑屏障,引起神经发育迟缓、神经元及突触可塑性改变,并诱发抑郁样行为。壬基酚(Nonylphenol,NP)是EDCs中典型的代表之一,课题组前期研究已证实:NP高剂量短期暴露具有神经毒性,孕期暴露后可导致子代神经反射延迟,成年后学习记忆衰减。关于NP长时间低浓度暴露是否诱导抑郁样行为产生未见报道,因此,本研究模拟机体实际接触状态进行暴露染毒,围绕NP能否诱导抑郁样行为,对神经元突触可塑性是否产生影响等展开了本研究。本研究分为动物实验和细胞实验两部分:第一部分通过动物实验阐明NP暴露诱发抑郁样行为及对突触可塑性改变的影响,选取判断抑郁的糖水偏好和强迫游泳等行为学实验研究抑郁样行为的发生,并通过血清测定神经递质和皮质酮(Corticosterone,CORT)的变化,同时通过HE染色、高尔基染色和电镜观察神经元和突触的形态改变。第二部分选取神经元HT22细胞,一方面验证NP对神经元形态及突触相关蛋白突触后致密物蛋白-95(Postsynaptic density-95,PSD-95)和突触素蛋白Ι(SynapsinΙ)的影响,另一方面探索NP致突触可塑性改变的可能机制。第一部分壬基酚慢性暴露致大鼠抑郁样行为及对神经元突触可塑性的影响目的:明确NP慢性暴露是否诱导大鼠抑郁样行为产生,同时观察对神经元突触可塑性产生的影响。方法:100只四周龄SD雄性大鼠随机分成5组,每组20只,分别为对照组(C,玉米油),NP低(L,NP 0.4mg/kg)、中(M,NP 4mg/kg)、高(H,NP 40mg/kg)剂量组和抑郁造模组(CORT 20 mg/kg)。在NP暴露90天和180天时测行为学(糖水偏好和强迫游泳实验)后,高效液相色谱法(HPLC)测定脑组织NP蓄积量,γ放免计数仪检测血清神经递质(五羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE))水平,ELISA法测血清皮质酮(CORT)浓度,取前额皮质和海马脑区行HE染色、高尔基染色和电镜观察神经元数量形态、突触可塑性及树突棘密度改变;Western blot检测突触相关蛋白(PSD-95、SynapsinΙ)的表达,实时荧光定量PCR检测突触相关m RNA(PSD-95、SynapsinΙ)的表达。结果:1.行为学实验:与对照组相比,随着NP暴露剂量和时间的增加,大鼠糖水偏好度降低(P<0.001)、强迫游泳实验中静止时间增加(P<0.05)。NP暴露组脑中NP浓度增加(P<0.05)。2.血清学检测:神经递质检测:NP中、高剂量组DA降低(P<0.05),NP组CORT浓度升高(P<0.05)。3.突触可塑性形态改变:1)HE染色:NP中、高剂量组大鼠神经元发生轻微皱缩和胞核固缩;2)高尔基染色:在前额皮质中,NP中、高剂量组细胞数量减少,树突上树突棘密度降低(P<0.05);3)电镜观察:与对照组相比,随着NP暴露剂量和时间的增加,海马突触间隙增宽、突触后致密物厚度和突触界面曲率降低(P<0.05)。4.突触相关蛋白及m RNA表达:1)Western b lot:与对照组相比,NP高剂量组PSD-95蛋白表达降低(P<0.001);2)RT-PCR:与对照组相比,PSD-95和SynapsinΙm RNA随着NP染毒浓度的增加表达降低(P<0.05)。结论:NP长期暴露可致大鼠抑郁样行为及突触可塑性改变。第二部分壬基酚对HT22细胞突触相关蛋白表达的影响目的:探讨NP对神经元HT22细胞NMDAR2B、PSD-95和SynapsinΙ蛋白表达的影响方法:用CCK-8法检测神经元吸光度值,据此计算出NP的半数最大抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)及NP对神经元有毒性作用的最低浓度,从而确定本次实验的NP暴露浓度。本次实验分为4组,分别为对照组(C)、NP组(NP,20μM)、N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)抑制剂组(地卓西平,MK-801,10μM)、NMDAR抑制剂+NP组(MK-801+NP)。MK-801+NP组为先加MK-801培养30 min后再暴露NP,NP暴露24小时做免疫荧光观察PSD-95和SynapsinΙ的表达、提取蛋白进行蛋白印迹法检测突触相关蛋白(PSD-95、SynapsinΙ)的表达情况。结果:1.NP暴露会抑制神经元的生长,NP的IC50为200μM,对细胞有毒性的最低浓度为20μM。2.NP暴露会使细胞形态发生皱缩。3.NP组和MK-801+NP组与对照组相比神经元SynapsinΙ荧光表达降低(P<0.001)。4.Western blot检测发现:NP组、MK-801组和MK-801+NP组与对照组相比NMDAR2B、PSD-95和SynapsinΙ蛋白表达降低(P<0.001),且NP组蛋白表达低于MK-801+NP组(P<0.001)。结论:NP暴露能降低神经元突触相关蛋白(NMDAR2B、PSD-95、SynapsinΙ)的表达,当抑制NMDA受体后会降低NP对上述突触蛋白的影响。