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视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma,RB)是在婴幼儿中发生的最常见的眼内恶性肿瘤,其侵袭转移能力强,严重危害着患者的生命以及视力。虽然目前的临床治疗水平逐渐提高,治疗目标也从拯救患儿生命到保存视力提高患儿生活质量,但部分患者就诊时已处于晚期,肿瘤已经向其他部位侵袭,治疗效果差。所以,实现挽救患者视力这样的治疗目标关键在于早期诊断。miRNA是一类短小序列的内源性非编码RNA,长度约为21-25个核苷酸,其通过影响互补mRNA的翻译和稳定性来调节转录后水平的基因表达发挥作用。在这一领域,越来越多的证据表明,miRNA可以通过下调致癌靶标或通过负调节抑癌基因蛋白的肿瘤启动子起到肿瘤抑制剂类似的作用。研究表明miR-125a-5p在多种人类肿瘤中表达异常,并发挥着抑制癌症的作用,抑制多种人类癌症的生长和转移,包括卵巢癌,肝细胞癌和乳腺癌。但miR-125a-5p在视网膜母细胞瘤中发挥的作用尚不清楚。1.研究材料和方法1.1临床样本的收集和细胞培养在视网膜母细胞瘤患儿进行眼球摘除手术过程中收集视网膜母细胞瘤组织及其配对的非肿瘤视网膜组织。标本收集后一部分迅速保存于液氮中,另一部份标本进行病理检查。购买视网膜母细胞瘤细胞株Y79细胞和WERI-Rb-1细胞。1.2视网膜母细胞瘤中异常表达miRNAs筛选及目标miRNA的选择与验证采用生物芯片初步筛选在视网膜母细胞瘤组织中表达水平显著改变的miRNAs,再使用实时定量PCR技术在临床视网膜母细胞瘤组织和视网膜母细胞瘤细胞株中对其中改变最为明显的miR-125a-5p进行表达验证。利用miR-125a-5p表达水平来区分视网膜母细胞瘤组织和正常视网膜组织。探索miR-125a-5p的表达水平与视网膜母细胞瘤病理特征的相关性。1.3 miR-125a-5p对视网膜母细胞瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响通过转染使miR-125a-5p在视网膜母细胞瘤表达水平增加,利用各种分子细胞生物学和显微成像技术,观察视网膜母细胞瘤细胞的增殖(细胞计数法、MTT法)、迁移(Transwell法)和侵袭(Matrigel侵袭实验)等细胞行为学的变化。1.4建立软琼脂克隆形成实验和裸鼠视网膜母细胞瘤模型,研究miR-125a-5p对视网膜母细胞瘤生长情况的影响软琼脂克隆形成实验检测miR-125a-5p的表达水平对视网膜母细胞瘤生长发展情况的影响。建立裸鼠皮下成瘤模型,裸鼠皮下注射视网膜母细胞瘤细胞,监测瘤体及小鼠生长情况。皮下注射1-2周后肉眼可见瘤体时,颈椎脱臼处死裸鼠,测量瘤体大小,使用公式V=LW2/2计算出肿瘤体积,绘制生长曲线。1.5 miR-125a-5p下游靶点TAZ的验证应用TargetScan、MiRanda和PicTar预测软件,分析相关因素,采用miRWalk数据库筛选出TAZ具有作为miR-125a-5p下游靶点的可能性。随后利用双荧光素酶报告基因实验验证miR-125a-5p对靶TAZ的负调控作用,在视网膜母细胞瘤细胞中过表达miR-125a-5p后使用蛋白印迹实验检测下游标靶TAZ的蛋白水平。分析视网膜母细胞瘤手术取得组织中TAZ的蛋白水平,并对其和miR-125a-5p的表达水平作相关性分析。1.6 miR-125a-5p下游直接靶点TAZ对视网膜母细胞瘤的生物学功能的研究利用RNAi技术敲低视网膜母细胞瘤细胞中TAZ的表达水平,利用各种分子细胞生物学和显微成像技术,观察视网膜母细胞瘤细胞的增殖(细胞计数法、MTT法)、迁移(Transwell法)和侵袭(Matrigel侵袭实验)等生物学行为的变化,再通过在已经过表达miR-125a-5p的视网膜母细胞瘤细胞中过表达TAZ探究逆转miR-125a-5p的抑制作用能够被逆转。2.主要研究结果2.1 miR-125a-5p在视网膜母细胞瘤组织和视网膜母细胞瘤细胞株Y79细胞和WERI-Rb-1细胞中的表达水平明显下调,miR-125a-5p的表达水平对于区分视网膜母细胞瘤组织和视网膜非肿瘤组织具有显著差异。统计学结果显示miR-125a-5p的表达水平与视网膜母细胞瘤的TNM分期存在显著相关性。2.2外源性过表达miR-125a-5p能显著抑制视网膜母细胞瘤细胞的增殖、迁移、侵袭及瘤体的生长。2.3 TAZ是miR-125a-5p的直接下游靶点。TAZ在视网膜母细胞瘤组织和细胞株中表达较配对的非肿瘤视网膜组织增高。过表达miR-125a-5p能明显降低TAZ的表达水平。MiR-125a-5p和TAZ在视网膜母细胞瘤中的表达水平呈负相关性。2.4敲低TAZ的表达水平能够抑制视网膜母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭的能力,与过表达miR-125a-5p作用相似。并且,在过表达miR-125a-5p的基础上再过表达TAZ能部分或完全逆转miR-125a-5p对视网膜母细胞瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和瘤体生长的抑制作用。3.结论3.1 miR-125a-5p在视网膜母细胞瘤组织中的表达水平明显下调,并与视网膜母细胞瘤TNM分期呈负相关,提示miR-125a-5p可能在视网膜母细胞瘤发生发展过程中发挥类似抑癌基因的作用。3.2过表达miR-125a-5p或敲低TAZ的表达水平均能明显抑制视网膜母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,miR-125a-5p过表达对视网膜母细胞瘤产生的抑制作用能被其下游直接靶点TAZ逆转,提示miR-125a-5p可能通过调控TAZ的表达来参与视网膜母细胞瘤的发生发展过程。3.3用miR-125a-5p的表达水平能显著区分视网膜母细胞瘤组织和非视网膜母细胞瘤组织。同时,miR-125a-5p及其下游直接靶点TAZ在视网膜母细胞瘤中的表达水平呈现负相关性,提示miR-125a-5p和TAZ均有可能成为视网膜母细胞瘤诊断或治疗的新靶点。