论文部分内容阅读
目的对斑马鱼的pGM-T-jak2a wt进行定点突变,完成pGM-T-jak2AV581F全长载体的构建,运用T7RNA聚合酶对含有jak2a基因的ORF区进行体外转录,在体外合成5端带有帽子结构的jak2a mRNA分子,为后续探讨斑马鱼MPD（Myeloproliferative disorders）模型的Jak/Stat信号通路奠定基础。方法根据jak2a基因GeneBank NM131093序列V581F突变位点的上下游序列片段设计引物,以pGM-T-jak2wt质粒载体为模板进行PCR后,用Dpn I酶对PCR扩增产物进行酶切消化去除模板,然后转化DH-5α感受态细菌,通过蓝白筛选酶切对阳性菌落进行鉴定,小量提取质粒,NdeI限制性内切酶完成pGM-T-jak2a质粒的线性化,运用T7RNA聚合酶对jak2a基因进行体外转录及加帽。最后经凝胶电泳对目的片段进行鉴定。结果完成PGM-T-jak2a V581F的定点突变,成功构建PGM-T-jak2a V581F载体,DNA序列分析的结果与GenBank上的序列（NM131093）一致,酶切线性化及体外转录加帽pGM-T-jak2a,凝胶电泳鉴定RNA分子大小与预期完全一致。结论成功完成斑马鱼pGM-T-jak2a V581F基因定点突变并体外转录及加帽pGM-T-jak2a。目的初步研究jak2a分子在斑马鱼的时空表达分布情况,通过在斑马鱼体内过表达jak2a mRNA分子,研究其对斑马鱼胚胎红系及髓系的造血影响,为构建斑马鱼骨髓增殖性肿瘤（MPN, myeloproliferative neoplasia）模型奠定基础。方法根据斑马鱼jak2a mRNA CDS编码区设计构并建合成反义的RNA探针,运用原位杂交技术及分子生物学等实验技术分析jak2a在斑马鱼体内的时空表达情况；通过显微注射技术完成斑马鱼体内jak2a分子的过表达,并检测其对红系及髓系造血的影响。结果成功构建jak2a mRNA分子探针,jak2a分子呈母系遗传；完成其在斑马鱼体内的过表达,Real-time PCR及Western blot结果提示完成jak2a分子斑马鱼体内过表达；斑马鱼体内过表达jak2a-wild type mRNA分子对红系及髓系造血具有明显的促进作用。结论jak2a基因在斑马鱼受精卵阶段有明显表达,具有母系遗传特征,斑马鱼体内过表达jak2a wt mRNA促进了红系及髓系造血系统的增殖,引起了类似于人类MPN的增殖表现。