miR-24在心肌细胞肥大中的作用与机制研究一、研究背景病理性心肌肥厚是促进心力衰竭发生发展的重要因素。心血管疾病的很多病理结果会导致心肌肥厚。心肌肥厚的特征表现为心肌细胞大小的增加与心肌胚胎基因表达的再激活。早期心肌肥厚为适应病理刺激的功能性改变,但持续病理性心肌肥厚会引起心功能失调,最终导致心力衰竭,甚至猝死。越来越多的研究表明miRNA对心肌肥厚起了重要调控作用。miRNA是一类高度保守的非编码小RNA,由约20个核苷酸组成,在人和动物中,miRNA通过碱基配对方式与靶基因mRNA的3’末端非编码区结合,促进靶基因mRNA降解或抑制蛋白质翻译,在转录后水平调节mRNA的表达。我实验中心既往研究发现,广谱表达的miR-24在心衰患者与大鼠肥厚的心肌中表达增加,提示miR-24与心肌肥厚存在相关性,但miR-24在心肌肥厚中的作用与机制并没有进一步阐明。在本研究中,我们构建SD大鼠心肌肥厚模型(腹主动脉缩窄法)与苯肾上腺素(PE)诱导的心肌细胞肥大模型,检测miR-24的表达水平;通过构建miR-24过表达腺病毒与miR-24 inhibitor并转染至乳鼠心肌细胞,观察心肌细胞形态、细胞表面积与心肌肥厚相关分子标志物变化,明确miR-24在心肌细胞肥大中的功能作用;最后,我们通过生物信息学分析方法、双荧光素报告基因和蛋白印迹技术对miR?24参与调控心肌肥厚的潜在机制进行了初步探讨。二、研究方法(一)大鼠心肌肥厚模型的构建雄性成年SD大鼠(180~200 g)采用戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉,无菌条件下开腹,分离暴露肾上腹主动脉,将4号缝线连同24号注射针与腹主动脉一并扎紧,然后拔除注射针,关腹缝合。假手术组(Sham组)除不缩窄腹主动脉外,其余处置同实验组(AAC组)。常规饲养2周后处死。(二)组织学分析处死AAC组与Sham组大鼠,取出心脏,4%多聚甲醛固定过夜,石腊包埋切片,苏木精和伊红(HE)染色,行病理组织学分析。(三)实时定量PCR(qRT-PCR)分析RNA采用Trizol试剂碎裂大鼠和培养的心肌细胞提取总RNA,逆转录酶催化,提取1 ug RNA用以制备cDNA。实时定量PCR使用SYBR Green试剂盒。目的mRNA基因采用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参,miRNA采用U6为内参。(四)原代心肌细胞培养与腺病毒转染取2~3 d龄SD乳鼠,酒精浸泡处死,取出心脏,眼科剪将心室肌剪切成1 mm~3组织块,0.1%胶原酶消化。细胞分离后,采用差速贴壁法去除非心肌细胞,加含15%胎牛血清DMEM培养液培养。心肌细胞贴壁48 h后,将重组腺病毒以50 MoI滴度转染心肌细胞。继续培养48 h后收集细胞,行RNA分析和细胞形态学观察。通过Lipo2000转染RNA抑制物来敲低内源性miR-24的表达。苯肾上腺素(PE,100 uM)诱导构建心肌细胞肥大模型。(五)心肌细胞的免疫组化分析待心肌细胞爬片后,取出盖玻片,用4%的多聚甲醛固定20 min,0.1%Triton X-100渗透化处理,加含5%山羊血清的PBS室温下终止2 h,然后与抗肌动蛋白抗体共孵育过夜。第二天用PBS洗涤3次,加入结合Alexa Fluor 555(分子探针)的二抗,洗涤后用荧光固定介质包埋玻片。莱卡TCS SP5显微镜采集细胞图像,徕卡图像分析软件测定细胞表面积。每组随机选取100个细胞进行分析。(六)双荧光素酶报告基因检测通过TargetScan miRNAs靶基因预测网站和软件,对大鼠miR-24的潜在靶基因进行预测。将潜在靶基因序列克隆至psiCheck2质粒中荧光素酶基因3’端非编码区。将荧光素酶报告质粒和miR-24过表达质粒混合共转染293T细胞,24 h后裂解细胞,进行荧光素酶分析。使用荧光素报告基因检测试剂盒在光度计下检测荧光素酶表达量。(七)蛋白免疫印迹(Western blotting)以miR-24过表达腺病毒或miR-24 inhibitor转染心肌细胞,用RIPA裂解液提取蛋白质,通过SDS-PAGE法将分离的蛋白质转移到PVDF膜上,5%脱脂牛奶封闭2 h,膜上与一抗孵育4℃过夜。TBST液洗涤3次,每次10 min,加入二抗孵育60 min,TBST重复洗涤3次,显影定影后扫描X片,将获得的条带图使用Image J软件进行灰度值分析。(八)统计分析方法实验数据采用均数±标准差表示。对照组的平均值定义为1。两组间比较采用未配对双尾t检验。三组间比较先采用方差分析,差异有统计学意义后,再采用SNK-q检验进行两两比较。采用Sigma Plot图像软件进行统计分析。P<0.05为有统计学意义。三、实验结果(一)miR-24在AAC诱导大鼠肥大心脏中表达水平上调AAC组与Sham组术后常规饲养2 w周后,处死大鼠,取心脏样本进行研究。HE染色显示AAC组术后2周心脏肥大。心重(HW)/体重(BW)的比值,与假手术组相比,AAC组大鼠HW/BW比值明显增加。心肌肥厚标志物检测结果显示:与假手术组大鼠相比,AAC组的ANP、myh7表达水平显著上调,而myh6表达水平显著下调,这表明大鼠心肌肥厚建模成功。然后采集心肌总RNA,实时定量PCR分析发现,在大鼠心肌肥厚模型心肌中,miR-24的表达量显著上调,提示miR-24在心衰心脏与心肌肥厚中可能起了重要作用。(二)miR-24过表达促进心肌细胞肥大将过表达miR-24腺病毒与表达GFP的腺病毒转染心肌细胞48 h后,采用qRT-PCR检测miR-24的表达量,结果发现:与GFP腺病毒转染组相比,miR-24腺病毒转染组miR-24表达量显著增加,差异有统计学意义。采用qRT-PCR对心肌肥厚标志物进行检测,在miR-24过表达组,myh6基因的转录水平下调约20%,而myh7和ANP基因的转录水平分别上调约20%和50%,差异有统计学意义,这些结果提示miR-24表达水平增加很可能影响心肌细胞的收缩功能。通过免疫组化及细胞表面积测定发现,与对照组相比,miR-24过表达组细胞表面积上调约1.2倍(P<0.05)。这些结果表明miR-24过表达促进心肌细胞肥大。(三)在PE诱导心肌细胞肥大模型中miR-24表达上调心肌细胞经100 uM PE诱导48 h后,多聚甲醛固定,免疫荧光染色,拍照后行细胞表面积分析,结果表明PE诱导组心肌细胞表面积增加约50%。心肌肥厚标志分子检测显示,与对照组比较,PE诱导组ANP与myh7表达上调,而myh6表达下调,差异有统计学意义。这些结果表明心肌细胞肥大建模成功。收集心肌细胞RNA,定量RT-PCR检测发现,PE诱导组心肌细胞中miR-24的表达量显著上调约50%。(四)miR-24参与了PE诱导的心肌细胞肥大为研究内源性miR-24在PE诱导肥大心肌细胞中的功能,我们使用miR-24inhibitor来敲低miR-24的表达。实验分为三组,空白对照组(Ctl组)、PE+NC inhibitor组、PE+miR-24 inhibitor组。以miR-24 inhibitor与NC inhibitor转染心肌细胞12 h后,再加入PE,继续孵育36 h,收集细胞进行后续功能分析。通过定量PCR检测miR-24表达水平发现,与PE+NC inhibitor组相比,PE+miR-24 inhibitor组的miR-24表达水平显著降低,差异有统计学意义。检测心肌肥厚标志分子的表达显示:抑制miR-24表达显著降低PE诱导的ANP与myh7上调(有统计学差异),但对PE诱导的myh6的下调无显著影响。细胞表面积测定:与空白对照组相比,PE+NC inhibitor组和PE+miR-24 inhibitor组细胞表面积都明显增加,差异有统计学意义;与PE+NC inhibitor组相比,PE+miR-24 inhibitor组心肌细胞的表面积更小,差异有统计学意义。这些结果表明:抑制miR-24表达能部分逆转PE诱导的心肌细胞肥大,表明miR-24是PE诱导心肌细胞肥大的部分必要条件。(五)miR-24靶基因的预测与验证通过Targetscan等生物信息学软件预测显示,ACVR1B、BCL2L11和MLEC可能是miR-24的潜在靶基因,每个基因可能存在1个或多个与miR-24作用的结合位点。双荧光素酶报告基因分析显示,过表达miR-24能明显抑制融合有ACVR1B和BCL2L11基因3’非编码区作用位点的荧光素酶的表达,表明miR-24直接靶向ACVR1B和BCL2L11基因的3’非编码区。另外,我们还发现,miR-24能特异性抑制融合ACVR1B的1568-1574位点,而不抑制438-445和953-959位点的荧光素酶报告基因的表达;在BCL2L11基因的3’非编码区,miR-24可直接抑制融合3’非编码区的473-480位点,而不抑制融合2651-2658位点的荧光素酶的表达。进一步通过Western blot检测发现,过表达miR-24显著减少ACVR1B基因的蛋白表达量,而抑制miR-24表达显著增加ACVR1B基因的蛋白质表达。这些结果表明ACVR1B是miR-24的靶基因。四、结论1.在腹主动脉缩窄法诱导肥厚的心肌与PE诱导肥大的心肌细胞中,miR-24表达显著上调。2.过表达miR-24促进心肌细胞肥大,抑制miR-24表达能部分转PE诱导的心肌细胞肥大。3.在心肌细胞中ACVR1B是miR-24的靶基因,miR-24通过抑制ACVR1B基因的表达促进心肌细胞肥大。