研究背景骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是一种以低骨量和骨组织微结构破坏为特征,导致骨质脆性增加和易于骨折的代谢性疾病。OP是引起老年人疼痛、骨骼变形及骨折的主要原因,也是一种低生活质量、高致残率、高病死率的疾病,给社会和家庭带来沉重的经济负担。我国骨质疏松患者居世界首位,现在约有9000万,占总人口的7.1%,而且随着我国老龄化社会的进程,骨质疏松症的发病率呈升高趋势。因此该病的预防和治疗已经成为我国公共卫生事业面临的严峻问题。现今防治骨质疏松的药物主要经过两个途径起作用：促进骨的形成、抑制骨的吸收。促进骨的形成药物有氟制剂和甲状旁腺激素1-34；抑制骨的吸收药物有雌激素、选择性雌激素受体调节剂、降钙素和双膦酸盐等；与上述的药物不同,雷奈酸锶(strontium ranelate, Sr)是首个上市(2004年10月获欧盟批准)的具有“双重作用”的药物。自2009年在中国上市以来备受关注,它代表了在骨质疏松治疗上一个新的发展方向,但是其机制仍未完全阐明,阻碍其在临床上的广泛的使用,因此有关Sr的相关机制研究已成为目前抗骨质疏松研究的热点。世界各地的学者在不同水平对锶盐进行了研究,但是其对骨的合成作用的分子机制仍未完全阐明。众所周知,成骨细胞是从骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)分化而来,目前,的研究集中在探寻锶盐对BMSCs的作用及可能的信号通路。为了证明锶盐对骨的合成作用机制,若干实验已经在细胞水平进行了阐述,如Yang F用锶盐处理人骨髓间充质干细胞后,发现锶盐可能通过Wnt通路来促进成骨分化。Peng S等发现锶盐能够通过激活Ras/MAPK信号通路以及下游的转录因子Runx2的活性促进BMSCs的成骨分化。BMP2/Smad通路是成骨细胞形成的重要通路,BMP2是促进骨形成和诱导成骨细胞分化最重要的细胞外信号分子之一,BMP2/Smad信号通路是骨髓间充质细胞分化为成骨细胞及骨细胞外基质合成、分泌所必需的,但是该通路是否在Sr促进BMSCs的成骨分化中起作用,目前国内外尚缺乏相关研究。本实验组前期实验已经证明：上调的BMP-2介导了Sr对BMSCs分化为成骨细胞的促进作用。本实验将进一步观察BMP-2/Smad通路在Sr促进BMSCs分化为成骨细胞过程中的作用。1.材料与研究方法1.1大鼠BMSCs的分离、纯化及培养取4周龄SD大鼠,雌雄不限,用颈椎脱臼法处死以后,在75%酒精里浸泡消毒10min,无菌条件下分离两侧股骨及胫骨,剪去股骨及胫骨的骨骺端,暴露骨髓腔,然后用DMEM-F12培养液(含10%胎牛血清、100U/ml青霉素及100μg/ml链霉素)不断冲洗骨髓腔20-30遍,至骨髓腔发白,收集含细胞的DMEM-F12培养液,1000rpm/min离心5min,弃上清,加入3ml的DMEM-F12培养液重悬细胞,接种在25cm2的培养瓶中,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。24h或48h后予细胞首次换液去除悬浮的血液细胞及未贴壁细胞。之后每隔2-3d换一次液,倒置相差显微镜下观察细胞生长状况及有无污染,直至细胞生长占据培养瓶瓶底近90%左右时进行传代。1.2大鼠BMSCs的成骨分化取第3-5代大鼠BMSCs,将细胞接种于培养皿或培养板中,加入成骨诱导液(含10%胎牛血清、10-8mol/L地塞米松、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μg/ml抗坏血酸的DMEM-F12培养液)培养。1.3Western blotting法检测磷酸化Smad1/5/8及Runx2蛋白表达水平取第3代大鼠BMSCs,将其接种于60mm培养皿中,给予不同的处理因素后,提取蛋白并定量,进行电泳后转膜,敷抗体曝光,并分析结果。1.4小干扰RNA (SiRNA)取第3代大鼠BMSCs,用不含双抗的DMEM-F12培养液接种于60mm培养皿中,待细胞增殖至70%左右时,用Lipofectamine2000转染Smadl SiRNA。转染48h后,各实验组给予不同的处理因素,用Western blotting法检测Smad1/5/8、磷酸化Smad1/5/8及Runx2蛋白表达；细胞连续培养,7天时检测ALP活性及21天时茜素红染色检测钙结节。1.5. Real-time PCR法测定小干扰后细胞中Smadl及Runx2基因的表达取第3代大鼠BMSCs,接种于25mm培养皿,给予不同的处理因素后,提取细胞RNA进行基因表达的检测。1.6碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性检测选取第3代大鼠BMSCs,接种于12孔板,给予不同处理因素后,培养7天后检测ALP活性。先将细胞收集后用细胞裂解液充分裂解,裂解后以12000r/min高速离心10min,取上清液依照ALP酶标仪检测试剂盒说明书进行操作,于酶标仪492nm波长处测定结果。1.7茜素红钙化结节染色取第3代大鼠BMSCs,接种于盖玻片上。给予不同处理因素后,培养21天后用细胞茜素红钙染色试剂对样本进行染色,观察钙结节染色情况。每组取3个样本,每样本随机取3个视野(×100),比较各组间的差异。1.8统计学处理计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,所有数据经SPSS13.0统计学软件进行统计学分析,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验,两两比较采用LSD检验。P<0.05时认为差异有统计学意义。2.实验结果2.1Sr上调BMSCs的磷酸化Smadl/5/8蛋白的表达BMSCs分别经0.1mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L Sr处理1h后,0.1mmol/L Sr开始使磷酸化(p-) Smadl/5/8表达增多,但与对照组比较差异不明显(P>0.05)；Sr浓度为1mmol/L时,p-Smad1/5/8表达水平明显升高,与对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。但是,当Sr浓度分别增加至为3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L时,与对照组相比,对p-Smad1/5/8表达无明显影响。另一方面,当Sr浓度为0.1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L时,与对照组相比,对Smadl/5/8表达无明显作用(P>0.05)；经1mmol/LSr分别处理BMSCs30min、1h、2h后,与对照组相比,细胞内p-Smadl/5/8表达均明显升高,其中BMSCs经Sr处理1h时,p-Smad1/5/8表达水平达到高峰,差异具有统计学意义(P<0.01),在处理6h时,p-Smad1/5/8表达水平显著下降接近对照组水平,差异无统计学意义(P>0.05)。2.2BMP-2拮抗剂noggin抑制Sr对磷酸化Smadl/5/8蛋白表达的上调作用BMSCs经1mmol/L Sr处理1h后,与对照组相比,细胞内p-Smad1/5/8表达明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01),先给予100ng/ml noggin预处理BMSCs2h后,可以显著地阻断Sr对p-Smad1/5/8表达的上调作用,差异具有统计学意义(P<0.01),提示BMP-2位于Smad1/5/8的上游,介导Sr对BMSCs Smadl/5/8的激活作用。2.3Sr上调BMSCs的Runx2蛋白表达BMSCs分别经1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L Sr处理6h后,与对照组相比,细胞内Runx2表达均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01),其中浓度为1mmol/L时,Runx2表达水平达到最高值(P<0.01)。当Sr浓度为5mmol/L时,Runx2表达的上升幅度下降,但仍明显高于对照组(P<0.05)。经1mmol/LSr分别处理BMSCs3h、6h、1d、3d后,与对照组相比,细胞内Runx2表达均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01),其中处理6h时,细胞内Runx2表达最多。2.4Smadl SiRNA降低Smad1/5/8蛋白的表达BMSCs分别经Smad1SiRNA01、Smad1SiRNA02、Smad1SiRNA03转染48h,与对照组相比,在Smad1SiRNA01、Smad1SiRNA02、Smad1SiRNA03组细胞内,Smad1/5/8表达均明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05),其中Smad1SiRNA02细胞内Smad1/5/8表达最少(P<0.01),所以后续的实验选用Smad1SiRNA02作为有效的SiRNA。2.5Smadl SiRNA抑制Sr对磷酸化Smadl/5/8蛋白表达的上调作用BMSCs用1mmol/L Sr处理1h后,与单独对照组相比,细胞内p-Smadl/5/8表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)；BMSCs经Smadl SiRNA转染48h后,可以显著地阻断Sr对p-Smadl/5/8表达的上调作用(P<0.01)。2.6Smadl SiRNA抑制Sr对Runx2蛋白表达的上调作用BMSCs用lmmol/L Sr处理6h后,与对照组相比,细胞内Runx2表达明显升高,差异具有统计学意义(P<0.01)；BMSCs经Smad1SiRNA转染48h后,可以显著地阻断Sr对Runx2表达的上调作用(P<0.01),提示Smad1/5/8通路介导Sr对BMSCs Runx2表达的上调作用。2.7Smad1SiRNA降低Smad1基因的表达BMSCs经Smad1SiRNA转染24h,再用1mmol/L Sr处理2h后,与对照组相比,Sr组细胞内Smad1基因表达无统计学差异(P>0.05)；与对照组相比,Si-smad1+Sr组,细胞内Smad1基因表达明显减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.8Smad1SiRNA降低Sr对Runx2基因表达的促进作用BMSCs经Smadl SiRNA转染24h,再用lmmol/L Sr处理2h后,与对照组相比,Sr组细胞内Rnux2基因表达明显增多,差异具有统计学意义(P<0.01)；与Sr组相比,Si-smad1+Sr组,细胞内Rnux2基因表达明显减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.9Smadl SiRNA抑制Sr对ALP活性的促进作用BMSCs用lmmol/L Sr处理7d后,与单独对照组相比,细胞内ALP活性显著增加,差异具有统计学意义(P<0.01); BMSCs经Smadl SiRNA转染48h后,抑制Sr对细胞内ALP活性的促进作用,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.10Smadl SiRNA抑制Sr对钙结节生成的促进作用BMSCs用1mmol/L Sr处理21d后,与单独对照组相比,细胞内钙结节数量明显增加；在Sr处理BMSCs前,用Smadl SiRNA转染48h,细胞内钙结节数量明显减少。单独Smadl SiRNA转染组的钙结节未见明显减少。3.实验结论(1)在BMSCs分化为成骨细胞的过程中,Sr上调了磷酸化Smadl/5/8及Runx2的表达；(2)BMP-2的拮抗剂noggin拮抗Sr对磷酸化Smad1/5/8表达的上调作用；(3)下调磷酸化Smad1/5/8的表达可抑制Sr的促成骨作用,表现为BMSCs Runx2表达减少、ALP活性降低及细胞内钙化结节数量显著减少上述提示BMP-2/Smad通路参与了Sr促进BMSCs成骨分化。