背景和目的脑出血为常见脑血管病。其具有高致残率、高死亡率的特点,并缺乏有效的治疗措施日益危害人类健康,为医学界所关注。既往其它神经系统疾病的研究已经证实黄体酮具有抗凋亡、抗自由基、抗炎、减轻神经兴奋毒性、减轻脑水肿、促进髓鞘再生与神经发生的作用。然而,目前尚未见到黄体酮治疗脑出血的研究报道。为发现脑出血有效的治疗手段及可能的治疗靶点,本项目拟研究黄体酮对脑出血小鼠的神经保护作用及对远期神经功能的影响。方法1.实验动物与分组:清洁级成年雄性C57BL/6小鼠(体质量25-35g,n=130),按照随机数字表法分为3组:(1)假手术(Sham-operated group,n=40),术中仅切开头皮并缝合;(2)溶剂治疗组(vehicle-treated ICH group,n=45),于脑出血成模后给予腹腔注射22.5%羟丙基-β-环糊精(HBC)溶液;(3)黄体酮治疗组(progesterone-treated group,n=45),于脑出血成模后给予腹腔注射黄体酮溶液。2.小鼠脑出血模型:采用胶原酶尾状核立体定位注射法建立小鼠脑出血模型。小鼠的尾状核定位于前囟左2.2mm,前囟前0.8mm,进针深度为2.9mm处。3.黄体酮溶液的配制及注射:将黄体酮粉末溶于22.5%羟丙基-β-环糊精(HBC)溶液中。黄体酮治疗组于脑出血后1 h腹腔注射黄体酮溶液(8mg/kg),并分别于脑出血后6、24、48h皮下注射黄体酮溶液;溶剂治疗组在相同时间点给予等体积的HBC治疗。4.实验观察指标:(1)早期组织病理学与形态学指标:(1)Ibal-1、MPO、GFAP免疫荧光染色检测脑出血后3d血肿周围活化的小胶质细胞、单核细胞的形态与数量及活化的星形胶质细胞的荧光强度;FJB免疫荧光染色检测脑出血后3d血肿周围变性的神经元;(2)Luxol fast blue/Cresyl Violet染色检测脑出血后3d血肿体积大小,脑肿胀程度;(3)干湿重法检测脑出血后3d时两侧大脑半球及小脑的含水量。(2)分子生物学指标:(1)细胞因子的检测:应用Western blot技术检测脑出血后1d时COX-1、COX-2、HMGB1、IL-1β、VEGF在血肿侧大脑半球的表达;(2)金属基质蛋白酶的检测:运用Gelatin Zymography(明胶酶谱法)检测脑出血后1d时出血侧大脑半球MMP-2与MMP-9的活性;⑶氧化应激反应的检测:于脑出血术后12h应用oxyblot评价出血侧大脑半球蛋白羟基化程度,并用Western blot技术检测nitrotyrosine的水平评价出血侧大脑半球蛋白硝基化程度;(4)Na+-K+-ATP酶表达水平的检测:应用Western blot技术检测脑出血后1d时Na-K-ATPase Ser23(NKA Ser23)、Na-KATPase Ser943(NKA Ser943)、Na-K-ATPaseα1(NKA-α1)、Na-K-ATPaseα3(NKA-α3)在血肿侧大脑半球的表达。(3)远期组织病理学及行为学评价:于脑出血后28d应用GFAP免疫荧光染色技术检测出血侧周围胶质瘢痕的厚度,Luxol fast blue/Cresyl Violet染色评价脑白质损伤情况、脑萎缩程度、残留脑损伤体积。分别于脑出血后1、3、7、14、21、28d应用24分神经功能评分系统评价神经功能的变化,并在该过程中记录肛温、体质量。5.统计学方法:采用SPSS17.0软件进行统计分析,定量资料均采用均数±标准差(c±s)来表示。死亡率采用卡方检验分析。Students’s t-检验用于两组间差异性比较。多组间差异性比较用单因素方差分析,组间两两比较采用Bonferroni检验。体质量、肛温及神经功能评分多组间的差异性分析采用重复测量方差分析,组间两两比较采用Bonferroni检验。P<0.05时差异有统计学意义。结果1.黄体酮对脑出血后组织病理学及远期神经功能的影响。1.1黄体酮治疗显著减轻脑出血急性期脑损伤程度。黄体酮治疗能够显著减小脑出血后3d脑血肿体积、脑肿胀程度(n=10-11/group,P<0.05)及脑组织含水量(n=6/group,P<0.05),与溶剂治疗组比较差异有统计学意义。1.2黄体酮治疗显著改善脑出血远期组织病理学改变并促进远期神经功能的恢复。脑出血后28d,溶剂治疗组胶质瘢痕的形成及脑白质损伤比较明显,经黄体酮治疗后,出血灶周围的胶质瘢痕厚度显著降低,与溶剂治疗组比较差异有统计学意义(n=6/group,P<0.05);出血灶周围脑白质损伤程度显著减轻,与溶剂治疗组比较差异有统计学意义(n=12/group,P<0.01)。脑出血后28d,溶剂治疗组和黄体酮治疗组均有不同程度的脑萎缩及残存的脑损伤病灶,与溶剂治疗组相比,黄体酮显著减轻脑萎缩程度(n=12/group,P<0.01);此外,黄体酮治疗显著减小残留病灶的体积,与溶剂治疗组比较差异有统计学意义(n=12/group,P<0.01)。1.3黄体酮治疗对小鼠肛温、体质量的影响。黄体酮治疗组小鼠的肛温与溶剂治疗组小鼠的肛温比较无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05)。黄体酮治疗组1、3、7、14、21d的体质量变化率与溶剂治疗组的比较,差异无统计学意义(n=12/group,P>0.05),但是脑出血后28d黄体酮治疗组小鼠的体质量增加显著高于溶剂治疗组小鼠,与溶剂治疗组比较差异有统计学意义(P<0.05)。黄体酮治疗组小鼠神经功能评分比溶剂治疗组显著降低在观察时间点7d至28d,与溶剂治疗组比较差异有统计学意义(n=12/group,P<0.05)。2.黄体酮对脑出血小鼠神经保护作用的机制。2.1黄体酮治疗显著下调血肿周围细胞炎症反应及变性神经元的数量。黄体酮显著下调脑出血3d病灶周围脑组织活化的小胶质细胞,变性神经元及单核细胞的数量,显著减少活化的星形胶质细胞的荧光强度,与溶剂治疗组比较有统计学差异(n=6/group,P<0.05)。黄体酮治疗对脑出血术后1d脑组织COX-1、COX-2的表达无影响,差异无统计学意义(n=3 mice for sham group,n=5 mice for each treatment group,P>0.05)。但黄体酮治疗显著下调了脑出血后1d血肿周围HMGB1、IL-1β、VEGF的表达,与溶剂治疗组相比差异有统计学意义(n=3 mice for sham group,n=5 mice for each treatment group,P<0.05)。2.2黄体酮治疗显著减轻出血侧大脑半球蛋白氧化应激反应的程度。溶剂治疗组和黄体酮治疗组小鼠脑出血后12h出血侧大脑半球蛋白羟基化和蛋白硝基化均有不同程度的升高。与溶剂治疗组相比,黄体酮治疗显著减少了急性期蛋白羟基化产物及蛋白硝基化产物(n=3 mice for sham group,n=5 mice for each treatment group,P<0.05)。2.3黄体酮治疗对基质金属蛋白酶活性的影响。黄体酮显著下调脑出血后1d血肿侧大脑半球脑皮质MMP-9的活性,与溶剂治疗组相比差异有统计学意义(n=3 mice for sham group,n=5 mice for each treatment group,P<0.05);但是并不影响MMP-2的活性(n=3 mice for sham group,n=5 mice for each treatment group,P>0.05)。2.4黄体酮治疗对出血急性期脑部Na+,K+-ATP酶水平的影响。黄体酮显著下调脑出血后1d出血侧大脑半球Na-KATPase Ser23的表达,与溶剂治疗组相比差异有统计学意义(n=3 mice for sham group,n=5 mice for each treatment group,P<0.01)。黄体酮显著上调脑出血后NKA-α3的表达,与溶剂治疗组相比差异有统计学意义(n=3 mice for sham group,n=5 mice for each treatment group,P<0.01)。黄体酮治疗对脑出血后12h出血侧大脑半球脑组织NKA-α1、Na-K-ATPase Ser943的表达水平无影响(n=3 mice for sham group,n=5 mice for each treatment group,P<0.01)。结论1.黄体酮治疗能够显著减轻脑出血急性期血肿体积大小、脑肿胀程度及脑组织含水量。2.黄体酮治疗能够显著减轻脑出血后急性期炎性细胞活化程度、降低炎症因子表达水平,减少神经元的变性程度、降低脑组织氧化应激反应,具有脑保护作用。3.黄体酮治疗通过显著下调脑出血急性期脑部MMP-9的活性、降低VEGF的表达、改变NKA的活性,该作用可能与黄体酮减轻脑组织含水量有关。4.黄体酮治疗可以显著下调出血28d后病灶周围胶质瘢痕厚度及脑白质损伤程度,并减轻脑萎缩程度及残存脑损伤体积、促进远期神经功能恢复。