蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是指由各种原因引起脑血管破裂致使大量血液直接流入蛛网膜下腔的一种临床综合征,70%的发病原因是颅内动脉瘤和脑血管畸形。尽管SAH仅占所有脑卒中发病率的5%,但据尸检报告估计,每年大约有10/10万人发生SAH。约12-15%的患者在接受有效治疗前死亡,入院后一个月内又有40%死亡,幸存者的致残率为50%,极高的死亡率和严重的致残率使这种疾病的治疗备受关注。目前已有的药物治疗研究都致力于改善脑血管痉挛减轻后遗症,手术技术、放射学和麻醉学也取得了重大进展,但SAH的死亡率和发病率并没有得到显著改善。近年,早期脑损伤(early brain injury,EBI)的概念被提出,EBI是指在蛛网膜下腔出血后72h内产生的病理生理改变,是造成SAH患者死亡及预后不良的主要原因。因此,EBI成为寻找SAH药物治疗新的关注点。在EBI的发生机制中,一方面,SAH后能快速激活炎症反应、兴奋性中毒等通路,造成血脑屏障破坏、神经细胞水肿乃至细胞坏死;另一方面,出血释放的细胞因子、颅压改变引起的应激反应及血管痉挛导致的缺血等,导致80%以上的SAH病人皮层或海马皮层中出现持续性神经元凋亡。不同机构的随机对照实验(randomized controlled trial,RCT)证明用Rho激酶抑制剂Fasudil或者甾体类药物如Hydrocortisone,methylprednisolone干预炎症引起的EBI,并没有明显改善预后,而且抗氧化应激和血小板反应的治疗效果也不理想。基于SAH实验动物的研究表明抑制神经元凋亡可以明显提高神经病学评分,提示过度的神经元凋亡可能是EBI的重要病理原因,干预神经元凋亡则是潜在的治疗SAH的有效途径。MAPK通路在EBI引起的神经元凋亡中起着关键作用。在细胞和动物水平抑制JNKs活性能有效抑制神经元凋亡,改善神经功能损伤。在MAPK通路中,JNKs主要被MKK4和MKK7激活。有研究通过敲除鼠证明,在神经元受到凋亡刺激时,是MKK7而不是MKK4激活JNKs。因此我们致力于寻找有效的药物靶点通过抑制MKK7来达到治疗EBI及改善预后的目的。我们的前期工作已经证明,HDACs在胶质瘤细胞中转录调控MKK7的表达。那么在神经元中,抑制HDACs会不会对MKK7的活性也产生影响?因此,本论文主要对以下几个方面的问题展开了研究:1.在神经元中,抑制HDACs能否降低MKK7的表达?2.通过抑制哪个HDAC成员降低了MKK7的表达?3.抑制这个HDAC成员能否通过降低MKK7的表达减少神经元的凋亡?4.在大鼠蛛网膜下腔模型中抑制HDAC4能否通过降低MKK7点表达改善神经功能损伤?实验方法和结果1.在神经元中,抑制HDACs降低了MKK7的表达1.1.撤钾条件下神经元MKK7、p-JNK、p-c-Jun的表达增加原代培养SD乳鼠小脑颗粒神经元作为体外实验的研究对象。以钾离子浓度为25m M的培养基(25K)模拟正常的电解质环境,以钾离子浓度为5m M的培养基(5K)作为撤钾条件刺激小脑颗粒神经元(CGNs),Western blot检测到在不同时间点,5K条件下神经元内MKK7、p-JNK、p-c-Jun的表达均增加。结果表明在撤钾条件激活了MKK7-JNK-c-Jun凋亡通路。1.2.在神经元中,抑制HDACs降低了MKK7的表达用多种组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylase inhibitor,HDACI)在5K条件下处理神经元12h。Western blot结果显示,与5K组比较,HDACI处理后MKK7的表达下降,说明抑制HDACs降低了MKK7的表达。2.抑制HDAC4降低了MKK7的表达2.1.HDAC4抑制剂降低了MKK7及p-c-Jun的表达用不同浓度的HDAC4抑制剂LMK-235分别在25K、5K条件下处理CGNs。Western blot检测到不论在25K还是5K条件,LMK-235处理后的神经元MKK7、p-JNK、p-c-Jun的表达均呈浓度依赖的减少;运用Trizol法提取RNA,PCR和琼脂糖凝胶电泳法检测,在5K条件下LMK-235处理后的神经元MKK7的m RNA表达减少。说明在CGNs中,LMK-235在转录水平抑制了MKK7的表达。2.2.小分子RNA抑制HDAC4的表达有效降低了MKK7及p-c-Jun的表达经过筛选,设计了小分子RNA片段抑制HDAC4的表达。由于神经元的转染率极低,选用大鼠胶质瘤细胞C6对该片段的有效性进行了验证。结果显示,与对照组比较,转染了si HDAC4-1、si HDAC4-2的细胞,HDAC4的蛋白表达均下调。说明该小分子干扰片段有效降低了HDAC4的表达。运用钙磷转染法在神经元中转染si HDAC4片段,共转染GFP标记转染成功的CGNs,运用免疫荧光检测MKK7、p-c-Jun的表达情况,结果显示与对照组比较,si HDAC4-1和si HDAC4-2组HDAC4、MKK7、p-c-Jun阳性率明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。再次验证了si HDAC4片段有效抑制了HDAC4的表达,也说明抑制HDAC4的表达有效降低了MKK7、p-c-Jun的表达。3.抑制HDAC4通过降低MKK7的表达减少了神经元的凋亡3.1.HDAC4抑制剂减少了神经元的凋亡在5K条件下用不同浓度的组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂LMK-235处理CGNs,运用Hoechst染核,对细胞的凋亡率进行统计学分析。结果显示,LMK-235处理过的神经元凋亡率显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。且在LMK-235浓度为1μM时凋亡率减少最多。结果说明在撤钾条件下,抑制HDACs通过抑制MKK7的表达抑制了神经元的凋亡。3.2.小分子干扰抑制HDAC4减少了神经元的凋亡运用钙磷转染法在神经元中转染si HDAC4片段,共转染GFP标记转染成功的CGNs,用25K或5K条件刺激神经元12h后运用Hoechst染核,最后计数并统计CGNs的凋亡情况。结果显示,5K条件下si HDAC4-1、si HDAC4-2的神经元凋亡率较对照组明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明抑制HDAC4通过抑制MKK7的表达抑制了神经元的凋亡。4.在大鼠蛛网膜下腔模型中抑制HDAC4通过抑制MKK7的表达有效改善早期神经功能损伤4.1.在蛛网膜下腔出血模型中,抑制HDAC4有效降低了MKK7、JNK、c-Jun的表达选取300g的雌性成年SD大鼠,脑室注射Vechile或LMK-235(1m M),24h后建立蛛网膜下腔出血模型,12h后选取建模成功的大鼠脑组织,运用组织匀浆法提取额叶蛋白,用Western blot检测MKK7、JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun等蛋白的表达情况,以GAPDH作为内参,对结果进行灰度分析,提示注射了LMK-235的大鼠MKK7、p-JNK、p-c-Jun的表达均降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。取上述大鼠的脑组织进行冰冻切片,用免疫荧光检测额叶p-c-Jun的表达情况,进行荧光度分析后提示注射了LMK-235的大鼠p-c-Jun的表达较对照组降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明脑室注射LMK-235,有效降低了大鼠蛛网膜下腔出血后MKK7、JNK、c-Jun的表达。4.2.在蛛网膜下腔出血模型中,抑制HDAC4对大鼠早期神经功能损伤起到了保护作用选取300g的雌性成年SD大鼠,脑室注射Vechile或LMK-235(1m M),24h后建立蛛网膜下腔出血模型,在建模后12h对大鼠的神经功能行为学进行评分,对建模成功的大鼠评分进行统计分析。结果提示注射了LMK-235的大鼠在蛛网膜下腔出血后早期的神经功能评分较对照组低,差异具有统计学意义(P<0.05)。说明脑室注射LMK-235通过抑制MKK7有效改善了大鼠蛛网膜下腔出血后早期神经功能损伤。结论1、在神经元中,抑制HDACs可以减少MKK7的表达;2、在神经元中,抑制HDAC4减少了MKK7的表达;3、抑制HDAC4通过降低MKK7的表达减少了神经元的凋亡;4、在大鼠的SAH模型中抑制HDAC4通过减少MKK7的表达有效改善了大鼠的早期神经功能损伤。