目的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是一种恶性程度高、预后凶险的肿瘤,5年生存率只有7%左右,是全球第五位最常见的恶性肿瘤,在全世界肿瘤患者的致死率中高居第三位。在我国,由于乙肝病毒(HBV)的高感染率而导致慢性肝病、肝硬化、肝癌的高发性。肝炎-肝纤维化-肝癌前病变-肝癌是慢性肝病的恶性发展过程,肝纤维化具有可逆性,早期诊断和治疗可阻断其向肝硬化方向发展；早期肝癌若得到及时治疗,可提高五年生存率。肝癌前病变是指在慢性肝病中出现的肝细胞不典型增生、腺瘤样增生、肝细胞再生结节、肝细胞小管状化生和卵圆细胞增生,其发展为肝癌的几率高,尤其是肝硬化病灶中出现的异型增生病灶或结节和异型增生的细胞。近年来,虽然肝癌的治疗取得了一定进展,但临床疗效仍未得到明显提高,因而阻止或延缓肝癌前病变的发生发展,预防肝脏癌症的发生,具有重要的现实意义。本文在前期实验的基础上,建立肝癌前病变大鼠模型,研究丹皮酚对肝癌前病变的预防效果及其药动学变化。方法1大鼠肝癌前病变模型的建立建立二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)诱发的肝癌前病变大鼠模型,DEN剂量分别为0.0、25、50、75、100mg/kg,给药18周,观察各组病理变化、异型性指数,回归各组异型性指数与造模处理对数小时时程之间的时效曲线,回归各剂量组曲线下面积(AUCi)与对数效能剂量之间的量效曲线,探讨二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌前病变的时效关系与量效关系。2丹皮酚对大鼠肝癌前病变的预防作用研究建立DEN诱发的肝癌前病变大鼠模型,采用丹皮酚进行预防干预,比较各组大鼠的一般情况及肝脏病理组织形态学、生化指标、形态计量相关指标的情况,并应用免疫组化、实时荧光定量PCR(RT-PCR)的方法检测大鼠肝组织甲胎蛋白(AFP)的表达。3丹皮酚在肝癌前病变模型大鼠体内的药动学研究建立DEN诱发的肝癌前病变大鼠模型,分别在病变不同阶段灌胃给予丹皮酚,观察丹皮酚在各阶段大鼠体内的药动学变化,并用免疫组化、RT-PCR的方法检测大鼠肝组织雌激素硫酸转移酶(estrogen sulfotransferase, SULT1E1)的表达。结果1大鼠肝癌前病变模型的建立在肝脏组织病变上,0.0mg/kg组各时程肝组织病变轻微,可找到灶性细胞水肿、小滴脂变或点状坏死；25.0、50.0mg/kg组随时程,肝组织有“变质-纤维化-肝硬化-异型增生”等阶段性病变；75.0、100.0mg/kg组随时程,肝组织“阶段性病变”出现早、程度重。随时程异型性指数增加,其中,5剂量组分别为0.21%-0.61%、0.20%-1.17%、0.27%-1.55%、0.29%-2.24%、0.30%-2.25%。以异型性指数(肝细胞核/浆体积比校正值),回归0、25、50、75、100mg/kg二乙基亚硝胺造模的半效时程(95%CI)分别为70347(0-)1734(937-3211)、1536(948-2490)、1530(890-2632)、1183(955-1466)h,曲线下面积分别为0.0064、0.0084、0.0123、0.0165、0.0167[异型性指数·log(h)]。以曲线下面积,回归二乙基亚硝胺诱发肝细胞癌前病变的半效剂量为48.255mg/kg。50.000mg/kg造模各时程的异型性指数与核分裂像总数之间呈直线正相关(y=0.0023x-0.0056,r=0.9217,n=10,P<0.01)。2丹皮酚对大鼠肝癌前病变的预防作用研究在大鼠一般情况上,模型组大鼠在予DEN腹腔注射第3周以后开始出现一些相关的病态表现,丹皮酚组大鼠病变程度较模型组轻。在大鼠肝脏大体形态上,对照组大鼠肝脏质地光滑柔软,颜色淡红；模型组大鼠肝脏颜色暗红、肿大,可见黄褐色细颗粒状结节生成；丹皮酚组大鼠肝脏表面相对光滑,结节较少、较小,肝脏表现界于对照组和模型组之间。HE染色显示,对照组肝小叶结构正常,肝索呈单行放射状排列在中央静脉周围,肝细胞无变性、坏死,肝窦无狭窄；模型组中央静脉偏离或缺如,肝索排列紊乱,肝血窦狭窄,在汇管区有大量的结缔组织增生,胶原纤维增生明显,广泛假小叶形成；可见大量肝细胞异型增生灶及异型增生结节,肝细胞大小不等,核仁明显,细胞核具有多形性；丹皮酚组大部分肝小叶结构接近正常,肝索排列仍较紊乱,肝细胞变性坏死、结缔组织增生程度较轻,肝细胞异型增生灶和异型增生结节数目明显减少。Mas son染色显示各组大鼠肝纤维化的情况与HE类似,而胶原纤维着色更为明显。相关形态计量指标分析结果表明丹皮酚可改善肝细胞异型性,提高单个假小叶体积比,降低单个肥大细胞释放量。生化指标测定结果表明丹皮酚能明显改善肝脏组织炎症,修复损伤肝细胞,减少脂质过氧化物对肝细胞的氧化性损伤。免疫组化结果显示,与模型组相比,丹皮酚组能明显减少AFP阳性灶数及其面积,有极显著性差异(P<0.01)。RT-PCR结果显示,与模型组相比,丹皮酚组AFPmRNA的相对表达量降低,有极显著性差异(P<0.01)。3丹皮酚在肝癌前病变模型大鼠体内的药动学研究生化指标测定结果表明由d000-d028-d056-d112，对肝细胞损伤逐步加重,机体的抗氧化能力依次减弱。免疫组化结果显示,各组肝组织均可见EST阳性表达,EST在肝细胞中的表达由d000-d028-d056-d112依次降低,在内皮细胞中的表达由d000-d028-d056-d112依次升高。RT-PCR结果显示,ESTmRNA表达水平由d000-d028-d056-d112依次降低。血液药动学结果显示,丹皮酚高、中、低剂量组,由d000-d028-d056-d112,吸收量和最大吸收浓度增加,表观分布容积和平均滞留时间减小,体内消除速率减小(中剂量组由d056-d112增加)。组织分布结果表明,相对于对照组,模型组大鼠吸收量和最大吸收浓度增加,体内消除速率减小(肺的增加),表观分布容积减小(胃的增加),肝、心、肾、胃的平均滞留时间增加,脾、肺、脑、肠的平均滞留时间减小。肝肾是主要的分布器官。结果表明丹皮酚在模型发展不同阶段的药动学存在一定差异。结论以异型性指数为指标,每隔84h腹腔注射1次二乙基亚硝胺,诱发♂大鼠肝细胞癌前病变的最佳造模剂量为48.255mg/kg,最佳造模累积连续时程为9周。丹皮酚可以明显改善肝癌前病变大鼠的相关指标,降低AFPmRNA表达,具有预防肝癌前病变的作用。建立用UPLC测定大鼠血浆及组织中丹皮酚浓度的方法,通过对丹皮酚在大鼠肝癌前病变模型各个阶段的药动学研究,证实丹皮酚在肝癌前病变模型发展不同阶段的药动学结果存在一定差异；通过丹皮酚在对照组和肝癌前病变大鼠体内的组织分布可知,丹皮酚主要分布在肝肾,其它组织也有分布。雌激素硫酸转移酶在肝脏表达的减少、肾脏表达的增加以及对丹皮酚的外排减少可能是影响其参数变化的主要原因。