研究背景：　　血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）主要是由血管内皮细胞和巨核细胞产生的一种多聚体糖蛋白，其分子量在500 kDa到10000 kDa之间。VWF通常以超大型VWF分子（ultra-large VWF，UL-VWF）的形式储存于血小板α颗粒和内皮细胞Weibel小体中。当血管壁受损时，VWF被释放出来，一方面通过其A3区与血管内皮基质的胶原结合；另一方面通过A1区与血小板糖蛋白Ibα（glycoprotein Ibα， GPIbα）结合，成为联系血小板和内皮基质的桥梁，从而参与到初期止血过程。VWF也是F VIII（Factor VIII，FVIII）的天然载体，保护FVIII逃避凝血酶的酶解作用，从而大大延长FVIII的半衰期。研究发现，血浆中发挥功能的主要是大分子量的VWF，而血管性血友病因子裂解蛋白酶（a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin type1 repeats，member13，ADAMTS13）能够与VWF分子A2区结合，将大分子的VWF切割为无活性的小片段，从而在维持 VWF不同分子量间的平衡上起着重要调节作用。　　VWF分子缺乏或缺陷将会导致血管性血友病（von Willebrand disease，VWD）， VWD是最常见的遗传性出血性疾病，发病率约为1%。VWF检测最初即是用于VWD的诊断和分型，通常先以VWF抗原（VWF antigen，VWF:Ag）、VWF瑞斯托霉素诱导GPIb结合试验（VWF Ristocetin-triggered GPIb binding assay，VWF:GPIbR）检测进行筛查，继而联合其他辅助检测做出确诊。急性心肌梗死（ acute myocardial infarction，AMI）是一种以动脉粥样硬化斑块破裂导致内皮基质暴露，诱发血栓形成，进而使冠状动脉闭塞而发生心肌缺血为病理特点的血栓栓塞性疾病。最新的调查显示，心血管病死亡已超越肿瘤，位居城乡居民总死亡原因的首位。研究发现，AMI同样也存在 VWF数量和质量的异常。因此，VWF被称作评估出血和血栓形成状态的风险因子，以VWF作为潜在抗血栓靶点的药物研究也受到了越来越多的关注。　　目的：　　传统检测 VWF:Ag和 VWF:GPIbR的酶联免疫吸附试验（ enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）繁琐耗时、可重复性低、灵敏度差，本研究旨在建立一种特异性高、准确性好，能够快速检测VWF:Ag，VWF:GPIbR的流式免疫微球技术（flow cytometric immunobead array，FCIA），进而将其应用于AMI的研究，并评估VWF:GPIbR和VWF多聚体分子在AMI发生发展中的作用。　　方法：　　（1）收集就诊于苏州大学附属第一医院的21例VWD患者、河南科技大学附属第一医院和苏州大学附属第一医院急诊科的146例AMI患者血浆，以及在门诊体检正常的105例正常志愿者血浆作为对照组（control，CTL）；　　（2） VWF:Ag-FCIA方法的建立：以抗人VWF单抗SZ29 IgG过夜包被微球，封闭后加入稀释的待测血浆孵育，最后加入异硫氰酸荧光素（ fluorescein isothiocyanate， FITC）标记的绵羊抗人 VWF IgG多克隆抗体（ FITC conjugated sheep-anti-human VWF IgG，FITC-GAH VWF IgG），反应过后在流式细胞仪上检测；　　（3） VWF:GPIbR-FCIA方法的建立：以抗人血小板糖蛋白Ibα单抗SZ151 IgG过夜包被微球，封闭后加入重组人血小板糖蛋白Ibα片段孵育，结束后同时加入稀释的待测血浆和瑞斯托霉素，最后加入FITC-GAH VWF IgG反应，反应过后在流式细胞仪上检测；　　（4）利用该方法检测VWD患者和CTL组血浆，并与经典的传统ELISA法进行方法学比较，评估FCIA法的可行性及优劣；　　（5）利用FCIA法检测AMI患者血浆的VWF:Ag和VWF:GPIbR水平；利用ELISA法检测AMI患者血浆的VWF胶原结合活性（von Willebrand factor collagen binding assay， VWF:CB）；利用荧光标记 VWF73底物荧光共振能量转移试验（FRETS-VWF73）检测ADAMTS13活性；利用VWF多聚体电泳分析CTL组和AMI患者血浆VWF分子的差异；　　（6）应用 SPSS19.0和 GraphPad Prism5.0软件分析上述指标，并评估VWF:GPIbR和VWF多聚体在AMI中的临床价值。　　结果：　　（1）成功建立了VWF:Ag-FCIA检测法，以MFI为纵坐标，以血浆稀释度为横坐标绘制的标准曲线有较好的线性关系（R2=0.9941）；该方法批内差异和批间差异分别为9.2%和12.6%，其敏感度、特异度、准确度分别为95.2%、89.5%、90.5%；经线性回归分析，其与VWF:Ag-ELISA法有较好的相关性（r=0.855，P<0.0001）。经Bland-Altman一致性检验，两种方法的偏倚为1.123%，95%一致性界限为（-45.06%，47.30%），因此 VWF:Ag-FCIA法和 VWF:Ag-ELISA法的一致性较好。此外， VWF:Ag-FCIA法与VWF:Ag-ELISA法相比，前者对超低水平的VWF:Ag检测灵敏度更高（1.22%vs6.41%），因此对3型VWD患者的诊断效果更好；　　（2）成功建立了VWF:GPIbR-FCIA检测法，以MFI为纵坐标，以血浆稀释度为横坐标绘制的标准曲线有较好的线性关系（R2=0.9876）；其批内差异和批间差异分别为7.7%和13.5%，其敏感度、特异度、准确度分别为95.2%、98.1%、97.6%；经线性回归分析，其与VWF:GPIbR-ELISA法有较好的相关性（r=0.813，P<0.0001），并与 VWF:GPIbR-ELISA法在特异度和敏感度上的差异有统计学意义。经Bland-Altman一致性检验，两种方法的偏倚为9.947%，95%一致性界限为（-41.00%，60.90%），因此VWF:GPIbR-FCIA法和VWF:GPIbR-ELISA法的一致性较好；　　（3） VWF:Ag-FCIA和 VWF:GPIbR-FCIA法的临床应用：AMI患者的血浆VWF:Ag、VWF:GPIbR水平均值显著高于CTL组（299.4%[37.3%-966.7%] vs73.5%[7.8%-193.3%]、242.0%[17.1%-1136.0%] vs65.5%[8.6%-189.0%]，所有P<0.0001）；AMI患者血浆的 ADAMTS13/VWF:Ag、 ADAMTS13/VWF:GPIbR、ADAMTS13/VWF:CB均值显著低于CTL组（0.25[0.03-1.30] vs1.16[0.24-4.82]、0.34[0.03-2.53] vs1.50[0.18-11.78]、0.29[0.04-1.66] vs2.43[0.51-14.23]，所有P<0.0001）；AMI患者血浆的 VWF:GPIbR/VWF:Ag、VWF:CB/VWF:Ag、VWF:GPIbR/VWF:CB均值与 CTL组相比，其差异无统计学意义（P>0.05）；AMI患者 PCI术前的血浆VWF:Ag、VWF:GPIbR、VWF:CB、VWF:GPIbR/VWF:Ag、VWF:CB/VWF:Ag与PCI术后相比，两者之间的差异无统计学意义（P>0.05）；　　（4） AMI患者的血浆 VWF:CB水平均值显著高于 CTL组（309.2%[21.2%-987.3%] vs75.6%[14.5%-342.1%]，P<0.0001）；AMI患者的血浆ADAMTS13活性均值低于CTL组（44.8%[28.3%-79.2%] vs48.8%[30.6%-86.4%]，P<0.01）；对AMI患者进行亚组（性别、年龄、支架个数等）分类，男性AMI患者的VWF:CB水平均值低于女性AMI患者（284.3%[29.6%-981.2%] vs397.9%[21.2%-987.3%]，P=0.0174）；年龄低于50岁者的 VWF:CB水平均值低于50岁以上者（238.0%[29.6%-878.5%] vs336.1%[21.2%-987.3%]，P=0.0271）；　　（5） VWF多聚体电泳分析：AMI患者血浆中VWF分子与CTL组相比，不仅VWF:Ag明显增多，而且UL-VWF分子也显著增多。　　结论：　　（1）成功建立了VWF:Ag-FCIA检测法，该方法与传统的ELISA法具有较好的一致性，且检测速度更快，对3型VWD诊断灵敏度更高；　　（2）成功建立了VWF:GPIbR-FCIA检测法，该方法与传统的ELISA法具有较好的一致性，且特异度更好，准确度更高；　　（3） VWF:Ag-FCIA和 VWF:GPIbR-FCIA检测法既可用于出血性疾病，如VWD的诊断，也可用于评估AMI患者的血栓形成风险；　　（4） AMI患者血浆中的VWF不仅数量明显增多，而且超大型VWF也显著多于正常人，这可能是导致心梗发生凶险的重要因素；血浆高水平的 VWF:Ag、VWF:GPIbR、VWF:CB、低水平的ADAMTS13活性有助于AMI的发生发展，这一发现为研制新型VWF拮抗剂提供了理论依据，并进一步丰富和完善了我国心脑血管疾病的发生机制，具有重要的临床价值。