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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒感染所引起的,主要导致母猪的繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病,同时该病具有免疫抑制和免疫逃逸的特性,有多种策略来逃避宿主的免疫清除作用和抑制宿主的免疫应答,造成持续性感染。主要组织相容性复合体Ⅰ(MHC-Ⅰ)存在于所有有核细胞的表面,主要参与内源性抗原的提呈,特别是病毒抗原。MHC-Ⅰ将经过加工的病毒抗原提呈至感染细胞表面,从而被CD8+T淋巴细胞所识别,活化的CD8+细胞毒性T淋巴细胞可以有效的清除被感染细胞,完成对病毒的清除作用。猪白细胞抗原Ⅰ(SLA-Ⅰ)是猪的主要组织相容性复合体Ⅰ类分子,也是由重链和β2m构成,其中β2m具有维持MHC-Ⅰ结构稳定的功能,而且在MHC-Ⅰ与抗原多肽的结合中发挥重要作用。自然界中,多种病毒具有不同的机制来干扰宿主对病毒抗原的提呈来逃避机体的免疫清除。而且有研究报道,PRRSV可以通过增加MHC-Ⅰ分子的泛素蛋白酶体降解来实现下调肺泡巨噬细胞(PAMs)表面MHC-Ⅰ分子的表达。为了进一步解析PRRSV下调细胞表面表面MHC-Ⅰ分子表达的机制,开展了本文的研究,希望能够通过更多研究来对PRRSV的免疫抑制和免疫逃逸机制提供更多样化的科学解释。首先,利用流式细胞术和间接免疫荧光的方法分析了PRRSV可以导致专职的抗原提呈细胞如PAMs、骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)MHC-Ⅰ分子表面表达下降以及可以感染PRRSV的猴源细胞Marc145的细胞表面MHC-Ⅰ分子的表达下降。进一步,本研究主要以高致病性的PRRSV毒株和Marc145细胞为材料,分别用针对MHC-Ⅰ-HC和β2m的单克隆抗体分析了细胞内MHC-Ⅰ和β2m的蛋白水平,结果显示PRRSV感染能够显著下调Marc145中MHC-Ⅰ和β2m的蛋白表达。当使用泛素化酶E1的抑制剂PYR41抑制蛋白的泛素化降解之后,β2m的蛋白水平依然无法恢复,而且realtime qPCR结果也显示,PRRSV可以降低Marc145以及PAMs内β2m的mRNA水平,即PRRSV可以抑制β2m的转录水平。然后,构建表达PRRSV各个结构蛋白和非结构蛋白的真核载体,将其转染Marc145和PK-15细胞,利用流式细胞术分析。结果表明,表达病毒非结构蛋白4(Nsp4)的真核表达载体转染的Marc145细胞和PK-15细胞表面MHC-Ⅰ分子的表达是下降的,同时β2m的转录水平和蛋白水平也是降低的。接下来,通过构建包含不同转录调控原件的β2m启动子调控区域序列,双荧光素酶报告基因系统检测结果表明Nsp4可以通过与β2m转录调控区域的调控元件结合抑制β2m的转录。ChIP-PCR结果也证明,Nsp4蛋白可以与β2m启动子调控区域序列结合,调控β2m的转录。综上所述,本文的研究表明,PRRSV可以通过抑制β2m的转录水平而降低β2m的蛋白表达量,从而下调细胞表面MHC-Ⅰ分子的表达,进一步影响病毒抗原的提呈,从而逃避CD8+细胞毒性T淋巴细胞对感染细胞的识别和清除,最终导致宿主对PRRSV的清除受到影响。为PRRSV的免疫抑制和免疫逃逸机制的研究提供了有科学依据的线索。