MicroRNA(miRNA)是一类非编码小RNA,在生物体中起着至关重要的转录后调控作用。MiRNA通常是通过RISC复合物与靶基因mRNA的3’未翻译区的靶位点序列互补结合,导致靶基因mRNA降解或者抑制其翻译成相关蛋白。一类miRNA往往能够同时调控多个具有相同靶位点的靶基因,与此同时,一个靶基因可能被多种miRNA进行调控。果蝇中的剪切增强子E(spl)m4基因是miRNA的靶基因,该基因存在于Notch信号途径末端,mi RNA通过调控E(spl)m4参与Notch信号途径调控,调节果蝇的神经发育。前期研究从家蚕中克隆得到了果蝇E(spl)m4的同源基因,并将其命名为BmEm4[Bombyx mori E(spl)m4],并获得了效价较高的BmEm4多克隆抗体。通过生物信息学分析发现,该基因的3’端未翻译区存在多个潜在的miRNA结合位点序列区(3个Brd box,1个GY box,2个K box等)。本课题研究了家蚕bmo-miR-79对BmEm4的调控作用,为研究家蚕miRNA对Notch信号通路的影响打下基础。基于前期研究成果,本研究进一步开展bmo-miR-79靶基因的双荧光素酶验证。首先通过PCR方法将BmEm4基因正常的3’UTR及靶位点序列Brd box、K box突变后的3’UTR克隆至p IEx-1-Rluc-Luc载体上(实验室构建的双荧光素酶载体)。将该重组载体与体外合成的bmo-miR-79 mimics及Negative control共转染家蚕BmN细胞,双荧光素酶报告基因法检测结果显示,与阴性对照相比,重组载体与bmo-miR-79 mimics共转染家蚕细胞后报告基因萤火虫荧光素酶催化底物的发光值降低,与此同时,由靶位点序列突变后的3’UTR构建的重组载体与阴性对照及bmo-miR-79 mimics共转染家蚕BmN细胞的结果并无明显差别。结果表明,BmEm4基因是bmo-miR-79的靶基因,且靶位点位于该基因的3’UTR的Brd box及K box区域。为了进一步验证bmo-miR-79对靶基因BmEm4的调控作用,我们用不同浓度的bmo-miR-79 mimics转染家蚕BmN细胞使其在细胞中上调,并用Western Blotting的方法检测了转染后不同时段的BmEm4的表达谱。转染不同浓度bmo-miR-79后BmEm4基因的翻译表达水平均有下调,高浓度bmo-miR-79转染后细胞中BmEm4蛋白下调显著,且在72 h后抑制效果达到近50%。为了验证bmo-miR-79在家蚕发育时期对BmEm4基因的表达调控作用,我们开展了bmo-mi R-79和BmEm4基因在家蚕发育时期的表达谱研究。结果表明,家蚕各个发育时期BmEm4及bmo-miR-79的表达水平差异明显各异,BmEm4蛋白的翻译水平相对转录水平来说受到不同程度的抑制,抑制程度由高到低依次为蛹、卵和蛾,研究结果进一步证明家蚕bmo-miR-79在家蚕发育时期对BmEm4表达进行了转录后水平的调控,可能进一步调控家蚕Notch信号通路。前期研究发现BmEm4基因在BmAGO2结合RNA中富集较多,是潜在的mi RNA靶基因。凝胶阻滞实验进一步证实bmo-miR-79能与具有生物活性的BmAGO2蛋白互作,表明bmo-miR-79可通过和BmAGO2蛋白结合形成的miRISC复合物对BmEm4进行转录后水平的调控,与以往miRNA行使基因调控功能的过程依赖于AGO蛋白等组成的RNA诱导沉默复合体的研究结论相符。BmEm4基因是家蚕Notch信号通路家族成员之一,关于家蚕Notch信号通路的研究至今甚少。本研究以我国重要的农业经济昆虫和鳞翅目昆虫模式生物家蚕为研究对象,开展miRNA对Notch相关基因的调控研究,对进一步研究家蚕生长发育过程中miRNA的许多基因调控机理具有重要意义。