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凋亡素(Apoptin)是鸡贫血病毒(CAV)的VP3蛋白,由121个氨基酸组成,多年来对Apoptin的研究证明它能选择性地诱导肿瘤细胞凋亡,而且在肿瘤的治疗中凋亡素是一个独立的因子,不受p53基因突变和Bcl-2基因的影响。这些特性预示凋亡蛋白有可能成为一种治疗因子选择性地诱导肿瘤细胞凋亡。但是凋亡素的作用靶点位于细胞核内,必须进入细胞核内才能发挥生物活性,所以寻找高效、安全的导向分子和转膜系统是应用影响凋亡素治疗效果的关键。黄体生成激素释放激素(luteinizing hormone releasing hormone,LHRH)是下丘脑分泌的一种调节性腺功能的激素,研究表明LHRH受体在卵巢癌、子宫内膜癌等细胞膜上呈特征性分布,即在肿瘤细胞表面有过量表达,所以可利用LHRH为靶向载体将治疗药物定向带到肿瘤细胞,达到将药物富集于肿瘤组织目的。近十年来,陆续发现了一些具有蛋白质转导结构域(protein transductiondomain,PTD)的蛋白质或多肽,它们可以携带多种物质,包括亲水性蛋白、多肽、DNA甚至颗粒性物质等进行细胞间/内的传输,并且不受细胞类型的限制,如TAT(11肽、13肽)、Antp(16肽)、VP22(34肽)、Transportan(28肽)、MAP(18肽)和PEA-Ⅱ(66肽)。为了寻找高效的转膜系统,提高凋亡素重组蛋白内化效率,本研究选用肿瘤细胞导向因子LHRH为导向分子,目前研究热点的TAT和PEA-Ⅱ分别作为转膜系统,凋亡素蛋白作为效应部分,通过PCR重叠延伸技术将Apoptin基因与肿瘤细胞导向因子LHRH基因分别与HIV-1 TAT和PEA-Ⅱ转膜系统基因重组,分别获得导向部位(LHRH)-转膜系统(TAT和PEA-Ⅱ)-凋亡蛋白两种融合蛋白基因,并通过原核表达系统实现了两种凋亡素重组融合蛋白基因LHRH-TAT-Apoptin(LTA)和LHRH-PEA-Apoptin(LPA)的表达和纯化。两种重组融合蛋白LTA和LPA分别对Heta细胞的凋亡作用显示,以HIV-1 TAT为转膜系统的凋亡素重组融合蛋白组LTA作用Hela细胞后细胞凋亡率高于LPA重组融合蛋白组,说明TAT的转膜效率高于PEA-Ⅱ。同时为了进一步检测TAT和PEA-Ⅱ的转膜效率,本研究还构建了以荧光蛋白(GFP)为报告基因的凋亡素重组融合蛋白基因LHRH-TAT-GFP-Apoptin(LTGA)和LHRH-PEA-GFP-Apoptin(LPGA)原核表达载体,经IPTG诱导表达并纯化。通过两种重组融合蛋白LTGA和LPGA分别作用Hela细胞后荧光强度显示,以TAT为转膜系统重组融合蛋白组LTGA作用Hela细胞后的绿色荧光明显强于PEA-Ⅱ重组融合蛋白组LPGA,进一步说明TAT的转膜效率高于PEA-Ⅱ。通过上述实验,一致证实TAT的转膜效率高于PEA-Ⅱ,确定了以TAT作为转膜系统可提高重组蛋白的内化效率,增强凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的能力,为进一步应用凋亡素重组融合蛋白导向治疗肿瘤奠定了基础。