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目的:
本实验优化并建立了基于UPLC-MS的细胞内裂解物代谢组学的检测方法;分析了雄激素非依赖性前列腺癌细胞模型与依赖性细胞模型细胞内代谢物全代谢图谱并筛选出明显差异代谢物;分析了其在雄激素非依赖前列腺癌转变转变过程中的作用及可能的转变发生机制。
方法:
1.细胞内代谢物标本的制备方法:采用预冷-40℃的60%(v/v)甲醇和0.85%(w/v)碳酸氢铵(PH7.4)溶液和预冷-20℃的40%(v/v)乙醇-0.8%(w/v)氯化钠溶液淬灭培养基,并利用甲醇和乙醇提取细胞内代谢物。
2.采用UPLC-ESI-Q-TOF/MS检测样品,对色谱质谱参数进行优化。选择ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱(100mm×2.1mm×1.7μm,美国Waters公司),采用电喷雾电离(ESI)源,正离子电离模式下进行质谱分析。TOF离子飞行方式采用V模式,使用亮脑啡肽([M+H]+的m/z556.2771)作为外标物对目标离子进行精确质量锁定。
3.数据分析方法:原始数据由MassLynx4.1数据处理系统采集,经MarkerLynx应用管理系统处理,建立一个包含样品种类名称、每一样品的峰数量(基于保留时间和对应质荷比)和归一化后的峰强度数据库,并将此数据库导入SIMCA-P+12.0软件(瑞典UmetricsAB公司)对数据进行Pareto缩放(Scaling),主成分分析(PCA)、偏最小二乘法辨别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法辨别分析(OPLS-DA)[3,4]。差异代谢物根据变异权重参数值(VIP)、VIP值置信区间、S图和载荷矩阵(loadingplot)进行筛选。结合多变量分析方法来研究雄激素依赖性前列腺癌细胞组和雄激素非依赖性细胞组代谢谱的变化规律,从而筛选明显差异代谢物,进而发现其雄激素非依赖性转变的可能机制。
结果:
1.优化确定采用预冷-40℃的60%(v/v)甲醇和0.85%(w/v)碳酸氢铵(PH7.4)溶液和预冷-20℃的40%(v/v)乙醇-0.8%(w/v)氯化钠溶液淬灭培养基,此两方法能迅速终止代谢反应,减小细胞膜的通透性、减少热不稳性和PH敏感性的代谢物丢失等优点,简单且重复性好。
2.应用UPLC-ESI-Q-TOF/MS,选择正离子模式,经方法学验证表明该方法重复性好、灵敏度高、分辨率高,适用于细胞内代谢物的快速、高通量检测。
3.数据经MarkerLynx处理,得到正离子模式下三组样品的信号峰,将信号强度相对总强度进行归一化处理后进行主成分分析,结果显示雄激素依赖性前列腺癌细胞组与非依赖性组代谢谱图有显著差别,但两组雄激素非依赖组之间未能完全分别聚类,进一步运用有监督的PLS-DA和OPLS-DA多变量统计方法对3组样本重新建模,结果显示雄激素依赖组与非依赖组之间能很好地区分,非依赖组之间也可很好分开,提示此模型可以很好的模拟临床雄激素非依赖性前列腺癌发展过程。为了分析不同组代谢物的变化趋势,对分组贡献(VIP值)较大的代谢物进行了提取并做了进一步鉴定:雄激素依赖到非依赖转变过程中存在差异的代谢物主要为磷脂类、鞘脂类和氨酰类其中,酰胺类、溶血磷脂酰胆碱、类固醇激素及植物鞘氨醇呈现减少趋势,而鞘磷脂呈增加趋势,含高不饱和度脂肪酰基的磷脂酰胆碱(总不饱和度之和大于10)在转变过程中呈现减少的趋势,而含低不饱和度脂肪酰基的磷脂酰胆碱(总不饱和度之和小于4)则呈现增加的趋势。
结论:
UPLCQ-TOF/MS方法能很好快速地筛选出已知或未知的代谢物,雄激素依赖性和非依赖性前列腺癌代谢物有明显差异,尤其是脂质代谢,提示雄激素非依赖性前列腺癌转变过程与脂质代谢发生异常密切相关。