恶性肿瘤是一类严重威胁人类生命健康的疾病。在各种疾病中,恶性肿瘤的死亡率高居第二位,仅次于心脑血管病。其中肝癌和结直肠癌分别位列恶性肿瘤发病率的第三、第四位。临床上针对此类实体瘤主要以手术、介入治疗及大剂量化疗为主,但传统化疗药物的长期应用使肿瘤细胞耐药现象越来越普遍,这大大影响了化疗药物的临床应用。因此,解决化疗中的耐药问题和优化化疗方案显得尤为必要。同时肿瘤的发生、发展是一个多基因、多因素和多阶段参与的复杂病理过程,单一疗法通常不能取得满意效果,综合治疗是目前肿瘤治疗的主要研究方向。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)是嘧啶类抗代谢药,在体内转化为5-氟脱氧尿嘧啶核苷酸(Fd UMP),抑制胸苷酸合成酶(TS)的活性,进而阻断脱氧尿嘧啶核苷酸(dUMP)转变为脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dTMP),干扰DNA合成。5-FU对消化道肿瘤及其他实体瘤有良好疗效。其缺点是缺乏对肿瘤细胞的选择性、毒性大、副作用多、久用易耐药等。Caspase家族属于半胱氨酸天冬氨酸-特异性蛋白酶,其家族成员在细胞凋亡过程中起重要作用。其中caspase-3做为细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶,负责整个凋亡级联反应过程的最终实施。正常情况下,胞质内caspase-3以无活性的酶原形式存在(procaspase-3),只有当细胞发生凋亡时才被激活为有活性的caspase-3。肿瘤细胞的抗凋亡特性,导致细胞内procaspase-3含量显著高于正常细胞,因此,靶向于procaspase-3药物对肿瘤细胞具有理想的选择性。半胱氨酸蛋白酶原活化物-1(简称PAC-1),在体外能够迅速活化procaspase-3为caspase-3并引起肿瘤细胞凋亡,并且对多种体内皮下移植瘤具有较好的抑制作用。SM-1为PAC-1的结构类似物,具有较好的抗肿瘤活性,有望成为新的靶向procaspase-3的抗肿瘤药物。本课题旨在研究靶向药物SM-1与化疗药物5-FU联合应用对人肝癌细胞及结肠癌细胞在体内外的协同抑制作用,并探讨其可能的作用机制。从而为两药联合应用提供依据。具体研究内容如下:第一部分sm-1联合氟尿嘧啶对人肝癌细胞及结肠癌细胞的体外增殖抑制作用目的:考察5-fu联合sm-1对人肝癌细胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人结肠癌细胞株hct116、lovo的体外增殖抑制作用。方法:1采用mtt法测定5-fu、sm-1单独应用及二者联合应用时对人肝癌细胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人结肠癌细胞株hct116、lovo的抑制率。2依据chou-talalay中效原理,以联合给药分析软件calcusyn2.1计算协同作用指数(ci)值,评价联合作用效果。结果:1mtt结果显示5-fu、sm-1单药对人肝癌细胞株hepg2、mhcc97h、lm3的抑制作用具有浓度依赖性。二者联合作用72h后,细胞抑制率明显升高,抑制作用增强。应用calcusyn2.1软件分析协同效果,二者在很大范围内具有协同作用。2mtt结果显示5-fu、sm-1单药对人结肠癌细胞株hct116、lovo的抑制作用具有浓度依赖性。二者联合作用72h后,细胞抑制率明显升高,抑制作用增强。应用calcusyn2.1软件分析协同效果,二者在很大范围内具有协同作用。结论:5-fu和sm-1联合给药对人肝癌细胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人结肠癌细胞hct116、lovo的增殖表现出协同抑制作用。第二部分sm-1联合氟尿嘧啶对人肝癌细胞及结肠癌细胞抑制作用的机制研究目的:考察5-fu联合sm-1对人肝癌细胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人结肠癌细胞株hct116、lovo协同抑制的作用机制。方法:1hochest33342染色观察联合用药对细胞形态的影响。2annexinv/pi考察联合用药对细胞凋亡的影响。3jc-1检测联合用药对线粒体膜电位的影响。4荧光定量pcr检测凋亡相关rna:bax、bcl-2、survivin、xiap以及parp。5westernblot检测凋亡相关蛋白:caspase-3、bcl-2、bax、survivin及parp。6transwell及划痕实验检测联合用药对细胞侵袭、迁移能力的影响。结果:1hochest33342染色结果显示,5-fu联合sm-1组细胞出现明显的凋亡特征,较单药处理组及对照组相比,有更多的典型凋亡细胞出现。2annexinv/pi双染结果显示,联合处理组细胞凋亡率较单独给药组明显增加。3jc-1检测结果显示,联合给药组细胞表现出绿色荧光增强,红色荧光减弱,线粒体膜电位较单独给药组显著降低。4荧光定量pcr结果显示:与对照组相比,各处理组中bax和parp基因表达显著升高,其中联合给药组升高最显著。bcl-2、survivin、xiap基因表达显著降低,联合给药组降低最明显。5westernblot结果显示:caspase-3蛋白在单药组及联合组的表达显著高于对照组,且联合给药组表达明显高于单药组。各处理组bcl-2及survivin蛋白表达较对照组低,且两药联合应用后蛋白表达较单药组明显降低。各处理组bax、parp蛋白表达较对照组增加,且联合给药组bax及parp蛋白表达也较单药组明显增加。6transwell及划痕实验显示联合用药显著降低肝癌细胞hepg2的侵袭和迁移能力。结论:5-fu和sm-1联合给药对人肝癌细胞株hepg2、mhcc97h、lm3,人结肠癌细胞株hct116、lovo的凋亡具有协同作用。协同诱导凋亡的机制可能是通过活化caspase-3,上调bax/bcl-2比例,下调survivin、xiap来实现的。第三部分sm-1联合氟尿嘧啶对人肝癌细胞及结肠癌细胞抑制作用的体内研究目的:建立人肝癌细胞裸鼠原位肿瘤模型和人结肠癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型考察5-fu联合sm-1的体内抗肿瘤效果。方法:1建立人肝癌细胞hepg2、mhcc97h裸鼠肝原位模型,给药结束后颈部脱臼处死动物,解剖取出瘤块,称重。通过瘤重反应5-fu、sm-1及二者联合应用的体内抗肿瘤作用效果。通过观察裸鼠的行为、活动及体重的变化来评估用药的安全性。2活体生物发光成像。建立稳定表达pcdh-gfp-luc的lm3-gfp/luc细胞。建立lm3-gfp/luc细胞裸鼠肝原位模型,通过小动物活体成像系统采集肿瘤自发荧光信号变化趋势及瘤重来考察5-fu、sm-1及二者联合应用的体内抗肿瘤作用效果。通过观察裸鼠的行为、活动及体重的变化来评估用药的安全性。3建立人结肠癌细胞hct116、lovo裸鼠皮下移植瘤模型,分组给药,每三天称体重、测量肿瘤体积。实验结束后颈部脱臼处死动物,解剖取出瘤块称重。通过肿瘤体积的变化趋势及瘤重来比较5-fu、sm-1及二者联合应用的体内抗肿瘤作用效果。通过观察裸鼠的行为、活动及体重的变化来评估用药的安全性。4肿瘤组织经石蜡包埋、切片,通过he染色、观察病理变化。结果:15-fu、sm-1及二者联合用药均可对hepg2、mhcc97h裸鼠原位移植瘤生长起到抑制作用。其中,联合给药对瘤重的抑制率最高,分别达到70.07%和86.74%。与对照组相比,5-fu、sm-1单独给药及二者联合给药均未对荷瘤裸鼠的行为、活动及体重产生明显影响。25-fu、sm-1及二者联合用药均可对lm3-gfp/luc裸鼠原位移植瘤生长起到抑制作用,其中,5-fu联合sm-1给药对瘤重的抑制率最高,达到75.11%。小动物活体成像系统显示,联合给药组肿瘤的自发荧光强度显著低于对照组(p<0.05)。与对照组相比,5-fu、sm-1单独给药及二者联合给药均未对荷瘤裸鼠的行为、活动及体重产生明显影响。35-fu、sm-1及二者联合用药均可对hct116、lovo裸鼠移植瘤生长起到抑制作用,其中,5-fu联合sm-1给药对肿瘤体积及瘤重的抑制率最高,对于hct116模型,瘤体积抑制率达到70.42%,瘤重抑制率为69.14%。对于lovo模型,瘤体积抑制率达到78.07%,瘤重抑制率为73.09%。与对照组相比,5-fu、sm-1单独给药及二者联合给药均未对荷瘤裸鼠的行为、活动及体重产生明显影响。4 HE染色结果显示:对照组肿瘤细胞结构完整。5-FU组、SM-1组及联合给药组肿瘤细胞均呈现不同程度的皱缩变圆、核固缩,以联合给药组的肿瘤细胞破坏最严重,凋亡最明显。结论:5-Fu和SM-1联合给药对人肝癌细胞HepG2、MHCC97H、LM3-GFP/Luc裸鼠原位肿瘤模型及人结肠癌细胞HCT116、LoVo裸鼠皮下移植瘤模型的生长具有协同抑制作用。