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研究背景与目的:目前认为G蛋白是与G蛋白偶联受体(GPCRs)结合的形式参与信号转导。我们课题组前期已发现G蛋白抑制性α亚基1/3(Gαi1/3)可通过新的方式参与信号转导:Gαi1/3在表皮生长因子(EGF)及角质细胞生长因子(KGF)活化下游AKT-mTORC1信号通路中起关键作用;生长因子与相应受体结合后,Gαi1/3与生长因子受体结合蛋白2(Grb2)相关结合蛋白1(Gab1)及生长因子受体形成复合物,并依次磷酸化Gab1、PI3K等相关蛋白。VEGF是一种同源二聚体所构成的糖蛋白,是新生血管形成中的关键因子。在本课题中,我们探究Gαi1/3是否在VEGF-VEGFR介导的下游信号通路中起到重要作用,并初步探索Gαi3是否在眼内新生血管形成中发挥作用。研究方法:(1)用VEGF分别处理几种小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs):野生型(WT)的MEFs细胞,Gαi1/3双敲除型(DKO)的MEFs细胞,Gαb1敲除的MEFs细胞,Gαi1单敲除型的MEFs细胞,Gαi2单敲除型的MEFs细胞,Gαi3单敲除型的MEFs细胞,野生型分别转入干扰Gαi1、Gαi3表达的siRNAMEFs细胞,野生型转入干扰Gαi1/3表达的shRNAMEFs细胞,双敲除型分别转入Gαi1、Gαi3基因的Rescue MEFs细胞。Western Blot方法检测细胞中衔接蛋白Gαb1以及MAPK/ERK 和 AKT-mTORC1 信号通路中相关蛋白(Akt,S6,mTOR,GSK3α/3β,Erk)的活化水平。(2)用VEGF分别处理脐静脉血管内皮细胞及沉默Gαi1、Gαi3基因的HUVEC。Western Blot方法检测相关蛋白的活化;MTT实验检测细胞的活性;细胞集落实验检测细胞增殖;体外成管实验检测管腔形成。(3)建立小鼠OIR模型,分别眼内注射Gαi3-shRNA、Scr-shRNA慢病毒,采用伊凡氏蓝-白蛋白染色法检测OIR小鼠视网膜血管渗漏从而比较新生血管形成情况。结果:(1)Western Blot结果显示:(给予VEGF处理后)与野生型(WT)MEF相比,Gαb1敲除、Gαi1/3双敲除型、shRNAMEFs细胞表现出Gαb1及下游AKT-mTORC1和MAPK/ERK信号通路中相关蛋白活化水平明显降低甚至缺失;Gαi1-siRNA、Gαi3-siRNA、Gαi1-KO、Gαi3-KO 的 MEF 细胞表现为 Gab1 及下游信号均有部分减弱,而Gαi2-KO的MEF细胞下游信号没有显著变化;重新转入Gαi1、Gαi3基因的Rescue MEF细胞,其下游信号通路活化水平有明显的提高。(2)Western Blot结果显示:(给予VEGF处理后)与Scr-shRNAHUVEC相比,Gαi1-shRNA、Gαi3-shRNAHUVEC 细胞表现出 Gab1 及下游 AKT-mTORC1 和MAPK/ERK信号通路活化水平降低,并且细胞功能受到抑制。(3)与眼内注射Scr-shRNA慢病毒的OIR小鼠相比,注射Gαi3-shRNA慢病毒的小鼠视网膜血管渗漏减少。结论:Gab1、Gαi1/3 在 VEGF 诱导的下游 PI3K-AKT-mTORC1 与 MAPK/ERK 信号过程中起重要作用。Gαi1/3参与血管内皮细胞的生长、增殖、体外管腔形成,Gαi3参与眼内新生血管生成。Gαi1/3与Gab1将有望成为抑制眼部新生血管治疗的新靶点。