神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)由于其自我更新能力和多向分化潜能(能够在体外分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞),为神经损伤和神经系统退行性疾病的治疗带来了希望。既往的研究发现低氧环境能够促进体外培养神经干细胞的存活和增殖。但这种低氧的微环境是如何影响神经干细胞增殖和代谢目前尚不知晓。因此,本实验首先观察了低氧对体外培养大鼠神经干细胞增殖和代谢的影响。而在我们前期的研究中显示,作为低氧环境中的最重要的调控分子之一的低氧诱导因子HIF-1(Hypoxia Inducible Factor-1)在低氧促神经干细胞增殖中发挥着关键的调控作用。但是其具体机制仍有许多未明之处。microRNA(miRNA)是一类21～23bp的内源性单链RNA,参与调控了多种基因的表达,并在细胞增殖、分化和凋亡等多种生物学进程中起到非常重要的作用。目前对miRNAs在肿瘤细胞中的表达调控及功能作了大量的研究,作为肿瘤细胞所处的微环境,低氧与miRNAs的关联也越来越引起人们的关注。那么,在低氧促神经干细胞增殖过程中是否有miRNAs的参与?因此,在本研究的第二部分中我们利用芯片分析了体外培养的神经干细胞中高表达的microRNAs,以及低氧对microRNAs表达变化的影响。并对在神经细胞中高表达的miR-21在神经干细胞中的作用进行了初步的探讨。主要结果如下:一.低氧对体外培养的大鼠胚胎中脑来源的神经干细胞增殖和代谢的影响1.大鼠胚胎中脑分离得到的神经干细胞均为Nestin染色阳性,并可在体外诱导分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞,说明我们成功地培养了神经干细胞,且NSCs纯度较高,可用于下面的实验。2.在低氧条件下,神经干细胞培养第3、5d时,细胞的增殖明显。表明低氧可促进神经干细胞的增殖。神经干细胞在低氧条件下培养后,代谢发生明显的变化。随着培养时间的延长,葡萄糖的利用增加,丙酮酸和乳酸的产生增加,培养液中pH降低,这种适度(轻微)降低的pH能促进暴露于低氧早期阶段的NSCs的增殖。3.在低氧条件下,神经干细胞的增殖增加,而细胞中ATP的产生在3 d、5 d时低于常氧组。低氧通过增加葡萄糖的转运,以及糖酵解途径中丙酮酸激酶的表达,来调节低氧环境中神经干细胞的代谢发生变化。二.miR-21的表达及对NSCs体外增殖的影响在此部分我们利用非编码RNA(ncRNAs)芯片筛选了一批在NSCs中特异表达和表达水平受低氧调控的非编码RNA,并进一步对miR-21在低氧时的表达和在神经干细胞中的作用进行了初步的探讨。1.用非编码RNA(ncRNAs)芯片分析低氧促NSCs增殖过程中ncRNA表达的影响,这些RNA可能在神经干细胞增殖中发挥了重要的作用。2.首次发现miR-21的表达在神经干细胞增殖过程中和细胞低氧、缺氧时的动态变化;在神经干细胞中高表达的miR-21在3 %低氧条件下,miR-21的表达较常氧组有所降低,但在0.3 %缺氧条件下miR-21的表达却明显高于常氧组和3 %低氧组。提示miR-21在神经干细胞的存活和增殖中可能具有一定的调节作用。3.首次研究发现过表达miR-21可以促进体外培养的NSCs的存活和增殖,特别是可以提高神经干细胞在缺氧时的存活能力。其调节的分子机制尚有待于进一步深入探讨。综上所述,适度的低氧可促进体外培养的神经干细胞的增殖;在低氧条件下,神经干细胞的代谢发生明显的变化,葡萄糖的利用明显增加,主要通过糖酵解代谢途径产生能量;低氧促进体外培养NSCs的增殖中,许多miRNAs的表达发生变化;其中在神经干细胞中高表达的miR-21,可以促进神经干细胞的存活和增殖,过表达后可以增加神经干细胞在缺氧时的存活率。以上结果将为神经干细胞的增殖调控和移植治疗提供理论基础。