研究背景内质网是细胞重要的细胞器,在蛋白质的折叠、质量控制、维持钙稳态等方面都极其重要,直接参与并影响细胞的各种生命活动。内质网的各种定位蛋白,如分子伴侣、酶等通过对新合成的蛋白肽链进行加工、折叠修饰,帮助蛋白质形成特定的空间构象并定向转运。Ca2+结合蛋白、二硫键异构酶等内质网定位蛋白不仅可以发挥分子伴侣作用,还可定位于细胞胞液、细胞外,参与细胞的增殖、迁移及恶性疾病如肿瘤的发生发展。Reticulocalbin 1(RCN1)具有钙离子结合蛋白的特点,是CREC家族成员之一。人源RCN1蛋白由位于染色体11p13的RCN1基因编码,全长331个氨基酸残基,其结构特点是:N端是一段信号肽,由29个氨基酸残基组成;中间区域包含6个EF-hand结构域;在羧基末端是一段内质网驻留信号HDEL。RCN1的定位与分布:RCN1是内质网定位蛋白,但也发现RCN1可定位干骨内皮细胞、前列腺癌细胞的表面,但机制不详;而且RCN1的C端的HDEL与典型的内质网定位信号KDEL有别,因此,RCN1也可分泌至胞外。RCN1主要分布于·分泌器官,不同器官的组成细胞中RCN1的表达高低不同。RCN1的功能:RCN1功能研究不多。研究显示,鼠源RCN1基因的纯合缺失可导致胚胎致死;另外,分泌的RCN1可作为配体,介导凋亡的神经细胞被吞噬。RCN1的表达异常与疾病、特别是肿瘤的关系引起关注,RCN1在高侵袭性的乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞中均呈高表达。而在前列腺癌中,RCN1在侵袭力较高的细胞中呈低表达。基于RCN1功能不详,相关研究初露端倪,尚需详尽探讨。本论文首先从临床样本、数据库对其表达进行分析,并通过细胞和动物实验初步探讨了 RCN1在前列腺癌中的作用。研究结果第一部分RCN1在前列腺癌组织中高表达1.RCN1在前列腺癌组织中高表达根据肿瘤基因数据库TCGA,oncomine已有的数据分析前列腺癌中RCN1的mRNA水平高,但是生存分析却显示高水平的mRNA与病人的生存率无显著相关性。本论文分别收集了前列腺癌组织样本11例,良性前列腺增生组织样本15例,利用免疫组化检测RCN1在癌组织和增生组织中的蛋白表达水平。结果发现前列腺癌组织中RCN1显著高表达。为了确定RCN1是否与前列腺癌的发生有关,利用免疫组化检测周期蛋白CyclinD1,临床样本检测结果显示,CyclinD1不仅在前列腺癌组织中低表达,在良性增生组织中也呈现低表达,且与RCN1的表达无相关性。2.RCN1表达与细胞增殖无相关性细胞水平的检测结果显示,RCN1的表达水平在激素非依赖、侵袭性较强的PC3细胞中RCN1的表达最低,低于RWPE1,即前列腺正常上皮细胞。前列腺癌LNCaP细胞中RCN1表达最高,DU145细胞中RCN1表达介于PC3和LNCaP细胞之间。因此,选用RCN1低表达的PC3过表达RCN1,细胞增殖结果却显示过表达RCN1对细胞增殖无显著影响。因此,RCN1可能与细胞增殖无关。第二部分下调RCN1的表达可促进不同前列腺癌细胞凋亡或坏死性凋亡DU145和LNCaP细胞RCN1表达高,我们利用流式细胞术分析降低RCN1表达对细胞周期、细胞存活的影响。1.下调RCN1阻滞DU145细胞于S期下调RCN1可影响细胞周期。下调DU145细胞中的RCN1,发现细胞周期阻滞于S期。下调LNCaP细胞中的RCN1可使周期阻滞在G2/M期。检测S期和G2/M期关键调控蛋白Cyclin B在前列腺癌组织和良性增生组织的表达,结果显示,前列腺癌组织中CyclinB显著高表达,且与RCN1具有一定正相关性。2.下调RCN1诱导DU145细胞凋亡DU145细胞中下调RCN1可以抑制细胞活力,引起细胞死亡。下调RCN1后DU145细胞凋亡现象明显,Caspase-3酶活性升高,WB结果显示PARP剪切带明显。Z-VAD-FMK是Caspase抑制剂,在下调RCN1后加入,可以逆转细胞凋亡。为了进一步验证,将DU145细胞注入裸鼠皮下成瘤,瘤内注射siRCN1。结果显示,瘤内注射siRCN1后肿瘤重量和体积显著低于NC组。结果证明,瘤内注射siRCN1可以下调瘤内细胞RCN1的表达,促进肿瘤细胞凋亡。所以,下调RCN1使DU145发生细胞凋亡。3.下调RCN1促进LNCaP细胞发生坏死性凋亡下调RCN1可引起LNCaP细胞死亡。下调RCN1后,LNCaP细胞坏死明显。但是,Caspase-3无明显变化,同时其底物PARP剪切无差异,Z-VAD-FMK不能逆转下调RCN1造成的LNCaP死亡。然而,Necrostatin-1,坏死性凋亡抑制剂,可以部分逆转LNCaP死亡。这说明下调RCN1能引起LNCaP细胞坏死性凋亡。第三部分下调RCN1引起DU145和LNCaP凋亡和坏死性凋亡的机制研究1.RCN1 下调引起内质网应激参与细胞凋亡和坏死性凋亡(1)下调RCN1诱导内质网应激下调RCN1可增强分子伴侣GRP78活性,同时PERK活性增强,eIF2α活性降低,表明内质网应激产生。下调RCN1可使DU145细胞CHOP被激活,诱导凋亡产生。另外,内质网应激抑制剂4-PBA 可逆转下调RCN1造成的DU145和LNCaP细胞死亡,说明内质网应激参与了 RCN1下调引起的DU145细胞凋亡和LNCaP细胞的坏死性凋亡。(2)Ca2+释放诱导细胞凋亡和坏死性凋亡下调RCN1后,CaMKⅡ被激活,说明胞液中的Ca2+增加。加入内质网钙库释放通道受体蛋白IP3R的抑制剂XestosponginC,可以部分逆转细胞死亡。而兰尼碱受体RyR抑制剂Ryanodine对下调RCN1造成的细胞死亡却无明显逆转作用。说明下调RCN1导致内质网内Ca2+通过IP3R通道释放到胞液中,Ca2+信号通路被激活,导致细胞凋亡和坏死性凋亡发生。2.PTEN参与下调RCN1诱导的细胞凋亡(1)PTEN参与下调RCN1诱导的DU145细胞凋亡通过前期实验数据初步推测,RCN1可能更多的参与维持细胞存活,而不是促进细胞增殖。结果证实,下调DU145细胞中的RCN1可降低AKT活性,LNCaP细胞无变化。这说明AKT通路参与了 RCN1下调诱导的DU145细胞的凋亡。通过遗传学背景分析,DU145是PTEN野生型前列腺癌细胞,在DU145细胞中,下调RCN1可使PTEN活性升高,AKT活性降低。而同时下调RCN1和PTEN,DU145细胞凋亡缓解,AKT活性水平升高,说明下调RCN1影响细胞的存活是通过PTEN/AKT通路。(2)AR和TP53可能参与下调RCN1诱导的LNCaP细胞坏死性凋亡雄激素依赖的LNCaP癌细胞,其增殖很大程度上依赖于雄激素/雄激素受体(AR),但实验结果证明,下调AR,RCN1略有变化,说明其可能参与介导RCN1下调引起的LNCaP死亡。LNCaP中TP53可以发挥正常功能,下调RCN1,TP53表达略有降低,说明AR和TP53可能参与了下调RCN1诱导的LNCaP细胞坏死性凋亡过程。结论:1.前列腺癌组织中RCN1显著高表达,但与病人生存率无相关性。周期蛋白Cyclin D1表达水平较低,与RCN1无显著相关性。过表达RCN1对细胞增殖无显著影响。2.下调RCN1后,DU145阻滞于S期,诱导DU145细胞凋亡。DU145裸鼠实验同样表明,在体内干扰RCN1也可以促进细胞凋亡。3.下调RCN1可引起前列腺癌LNCaP细胞发生细胞坏死性凋亡。4.下调RCN1引起的细胞凋亡和坏死性凋亡均依赖于内质网应激以及Ca2+释放。但不同的是,下调RCN1激活了 DU145细胞内的PTEN,抑制AKT活性,细胞凋亡产生。而AR和TP53可能参与了下调RCN1引起的LNCaP细胞的坏死性凋亡。创新点与不足之处1.创新点(1)首次报道内质网蛋白Reticulocalbin-1(RCN1)在前列腺癌组织中高表达,并通过肿瘤基因数据库分析RCN1表达水平与病人生存率无显著相关性。(2)首次报道RCN1可能参与调控细胞周期,但对TP53野生的LNCaP细胞作用并不显著;且与促进细胞增殖相比,RCN1可能更多的参与维持细胞存活。(3)首次报道RCN1下调可通过内质网应激、CaMKⅡ的活化、PTEN活化、抑制AKT活性参与DU145细胞凋亡。对TP53野生的LNCaP细胞,下调RCN1可通过内质网应激、CaMKⅡ的活化调控诱导LNCaP细胞坏死性凋亡。2.不足(1)文献报道,CaMKⅡ活化可介导坏死性凋亡,因此本论文中对于LNCaP的坏死性凋亡并未做过多研究。(2)本论文只探讨了与细胞增殖、存活相关的AKT信号通路,而与细胞增殖相关的ERK通路是否也参与了 RCN1的作用需要进一步探讨和讨论。