论文部分内容阅读
目的：
结直肠癌是全世界最常见的癌症之一，晚期转移患者的疗效仍不理想，存活率较低。研究显示，上皮-间质转化(EMT)是癌症转移的早期步骤，而细胞间重要的粘附分子E-cadherin降低是EMT的关键环节。调节E-cadherin的因素众多，前期研究显示:Slit2-Robo1能使E-cadherin磷酸化，然后经Hakai泛素化、降解，从而诱导EMT。但Slit2-Robo1诱导E-cadherin磷酸化降解的具体机制尚不清楚。本研究的目的是探索Slit2-Robo1诱导结直肠癌细胞E-cadherin磷酸化降解的具体机制，为抑制肿瘤转移提供新靶点。
方法：
1.构建HCT116/V、HCT116/Robo1和HCT116/Robo1/Slit2稳定过表达细胞株，用免疫沉淀和Western-blot方法检测Slit2-Robo1对Src活性以及E-cadherin磷酸化的影响。敲除HCT116/Robo1/Slit2细胞中的Src，观察E-cadherin的磷酸化和降解有无变化。
2.用免疫共沉淀的方法检测三种细胞株中Robo1、Src和E-cadherin的结合情况。用全长或各种缺失突变的E-cadherin质粒和全长Robo1质粒共转染HEK293细胞，用免疫共沉淀的方法检测Robo1与E-cadherin的结合位点。然后，构建重组纯化蛋白His-CC3（Robo1胞内区C末端区段）、GST-Src、GST-E-cadherin和GST-N-cadherin，检测Robo1与Src、E-cadherin是否直接结合及是否介导E-cadherin与Src结合，检测N-cadherin能否与Robo1结合，以及Src和Robo1的结合位点。
3.构建含有Robo1胞内区CC3段的质粒，转染HCT116/Robo1/Slit2细胞，观察Robo1、Src和E-cadherin之间的相互作用，检测Src的活性以及E-cadherin的磷酸化、泛素化和降解，通过细胞免疫荧光染色观察细胞形态并检测其迁移能力。
结果：
1.hSlit2能激活HCT116/Robo1细胞中的Src，诱导E-cadherin磷酸化;但经R5（Slit2-Robo1结合阻断抗体）处理后，hSlit2的作用消失。敲除HCT116/Robo1/Slit2细胞中的c-Src之后，hSlit2无法磷酸化E-cadherin，E-cadherin降解被抑制。
2.只有HCT116/Robo1/Slit2细胞中能检测到Robo1与E-cadherin、Src结合（该作用可被R5抑制），而HCT116/V和HCT116/Robo1细胞中未发现;HCT116/V细胞中Src不与E-cadherin结合。HEK293细胞转染实验发现Robo1的CC3段与E-cadherin胞内段结合。重组蛋白实验结果显示Robo1的CC3段能与E-cadherin直接结合，而不与N-cadherin结合;Src的SH2/SH3能与CC3段直接结合，而单独的SH2或SH3与CC3段结合较弱。
3.Robo1CC3段过表达的HCT116/Robo1/Slit2细胞中，与Robo1结合的E-cadherin和Src明显减少，Src活性降低;E-cadherin的表达水平升高，泛素化减弱，降解减少。细胞免疫荧光染色观察到细胞从梭形、多边形变成了类圆形。
结论：
1.Slit2与Robo1结合诱导Robo1胞内区与Src结合，活化Src激酶，促进E-cadherin与Src激酶结合，诱导E-cadherin磷酸化、泛素化及降解。
2.Slit2诱导Robo1与胞浆内的E-cadherin、Src形成三聚体，Robo1的CC3段分别与E-cadherin胞内区和Src的SH2/SH3区直接结合，充当连接蛋白介导E-cadherin与Src的结合。
3.Robo1的CC3段可作为竞争分子，竞争性抑制Robo1-Src-E-cadherin三聚体形成，从而降低Src的活性，抑制E-cadherin磷酸化和泛素化，阻止E-cadherin降解，从而抑制EMT，可作为肿瘤治疗备选靶点。
结直肠癌是全世界最常见的癌症之一，晚期转移患者的疗效仍不理想，存活率较低。研究显示，上皮-间质转化(EMT)是癌症转移的早期步骤，而细胞间重要的粘附分子E-cadherin降低是EMT的关键环节。调节E-cadherin的因素众多，前期研究显示:Slit2-Robo1能使E-cadherin磷酸化，然后经Hakai泛素化、降解，从而诱导EMT。但Slit2-Robo1诱导E-cadherin磷酸化降解的具体机制尚不清楚。本研究的目的是探索Slit2-Robo1诱导结直肠癌细胞E-cadherin磷酸化降解的具体机制，为抑制肿瘤转移提供新靶点。
方法：
1.构建HCT116/V、HCT116/Robo1和HCT116/Robo1/Slit2稳定过表达细胞株，用免疫沉淀和Western-blot方法检测Slit2-Robo1对Src活性以及E-cadherin磷酸化的影响。敲除HCT116/Robo1/Slit2细胞中的Src，观察E-cadherin的磷酸化和降解有无变化。
2.用免疫共沉淀的方法检测三种细胞株中Robo1、Src和E-cadherin的结合情况。用全长或各种缺失突变的E-cadherin质粒和全长Robo1质粒共转染HEK293细胞，用免疫共沉淀的方法检测Robo1与E-cadherin的结合位点。然后，构建重组纯化蛋白His-CC3（Robo1胞内区C末端区段）、GST-Src、GST-E-cadherin和GST-N-cadherin，检测Robo1与Src、E-cadherin是否直接结合及是否介导E-cadherin与Src结合，检测N-cadherin能否与Robo1结合，以及Src和Robo1的结合位点。
3.构建含有Robo1胞内区CC3段的质粒，转染HCT116/Robo1/Slit2细胞，观察Robo1、Src和E-cadherin之间的相互作用，检测Src的活性以及E-cadherin的磷酸化、泛素化和降解，通过细胞免疫荧光染色观察细胞形态并检测其迁移能力。
结果：
1.hSlit2能激活HCT116/Robo1细胞中的Src，诱导E-cadherin磷酸化;但经R5（Slit2-Robo1结合阻断抗体）处理后，hSlit2的作用消失。敲除HCT116/Robo1/Slit2细胞中的c-Src之后，hSlit2无法磷酸化E-cadherin，E-cadherin降解被抑制。
2.只有HCT116/Robo1/Slit2细胞中能检测到Robo1与E-cadherin、Src结合（该作用可被R5抑制），而HCT116/V和HCT116/Robo1细胞中未发现;HCT116/V细胞中Src不与E-cadherin结合。HEK293细胞转染实验发现Robo1的CC3段与E-cadherin胞内段结合。重组蛋白实验结果显示Robo1的CC3段能与E-cadherin直接结合，而不与N-cadherin结合;Src的SH2/SH3能与CC3段直接结合，而单独的SH2或SH3与CC3段结合较弱。
3.Robo1CC3段过表达的HCT116/Robo1/Slit2细胞中，与Robo1结合的E-cadherin和Src明显减少，Src活性降低;E-cadherin的表达水平升高，泛素化减弱，降解减少。细胞免疫荧光染色观察到细胞从梭形、多边形变成了类圆形。
结论：
1.Slit2与Robo1结合诱导Robo1胞内区与Src结合，活化Src激酶，促进E-cadherin与Src激酶结合，诱导E-cadherin磷酸化、泛素化及降解。
2.Slit2诱导Robo1与胞浆内的E-cadherin、Src形成三聚体，Robo1的CC3段分别与E-cadherin胞内区和Src的SH2/SH3区直接结合，充当连接蛋白介导E-cadherin与Src的结合。
3.Robo1的CC3段可作为竞争分子，竞争性抑制Robo1-Src-E-cadherin三聚体形成，从而降低Src的活性，抑制E-cadherin磷酸化和泛素化，阻止E-cadherin降解，从而抑制EMT，可作为肿瘤治疗备选靶点。