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气道炎症反应是多种呼吸系统疾病的共同病理特征,主要包括感染性气道炎症反应和过敏性气道炎症反应。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是呼吸系统最常见的感染病原体,其感染后气道炎症反应以中性粒细胞浸润为主。哮喘则是以气道炎性细胞浸润、气道高反应性和气道黏液分泌增加等为特征的过敏性疾病,中性粒细胞在其病理过程中也发挥重要作用。目前研究发现,Th17细胞及其分泌的细胞因子IL-17A、IL-17F等在以中性粒细胞浸润为特征的气道炎症反应中发挥关键作用。因此,拮抗IL-17A和IL-17F的功能成为抑制气道炎症反应的重要途径。我们对IL-17A和IL-17F与肺炎链球菌感染所致气道炎症反应的关系进行了实验研究,并在此基础上进一步研究IL-17A和IL-17F与过敏性气道炎症反应的相互关系。根据Lanre Delavallée的理论,当自身蛋白与外源性蛋白结合,通过外源性蛋白提供Th细胞抗原表位,可激活T-B细胞反应,活化B细胞,产生抗自身蛋白的抗体。因此,我们设想若在体内诱导产生抗IL-17A和IL-17F的自身抗体,抑制IL-17A和IL-17F的功能,可望有效减轻气道炎症反应。耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)无致病性,且具有免疫调节功能,是基因工程疫苗的常用载体。Ag85A是卡介苗(BCG)免疫原性较强的分泌蛋白复合体Ag85的组分之一,能够促进Th1型免疫反应。本实验拟构建重组耻垢分枝杆菌疫苗,以Ag85A为外源性蛋白提供Th细胞抗原表位,在小鼠体内诱导产生抗IL-17A和IL-17F自身抗体,研究其抗气道炎症反应的相关机制。目的:构建表达Ag85A-IL-17A/F重组耻垢分枝杆菌r MS-Ag85a-IL-17a/f,体内诱导产生抗IL-17A和IL-17F自身抗体,并探讨其抗气道炎症反应相关机制。方法:本实验拟分三步进行:(1)r MS-Ag85a-IL-17a/f的构建及体内诱导自身抗体产生:利用分子克隆技术,将Ag85a-IL-17a/f基因片段克隆至穿梭表达载体p MFA42S中,构建获得重组质粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a/f,并电转化至耻垢分枝杆菌中,获得r MS-Ag85a-IL-17a/f。经Western blot鉴定蛋白表达。以重组耻垢分枝杆菌鼻腔黏膜免疫小鼠,ELISA法检测小鼠血清中抗IL-17A和IL-17F自身抗体的滴度以及肺组织匀浆中IL-5、IL-12和IL-17A等细胞因子的浓度;RT-PCR法检测肺组织中转录因子T-bet和GATA3的m RNA表达情况。HE染色观察小鼠肺组织病理改变。(2)r MS-Ag85a-IL-17a的体外功能研究:r MS-Ag85a-IL-17a体外感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,以MS为对照组,观察r MS-Ag85a-IL-17a对巨噬细胞凋亡、吞噬功能的影响,Griess法检测细胞培养上清中NO的分泌情况,ELISA法检测细胞培养上清中IL-6、MIP-1α、TNF-α、IL-10的分泌水平,RT-PCR法检测细胞内IL-6、IL-10、Defb-2及i NOS的m RNA表达情况。(3)r MS-Ag85a-IL-17a抗哮喘小鼠气道炎症反应机制的研究:构建小鼠哮喘模型,以r MS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜免疫干预。实验动物分为PBS组,哮喘组,重症哮喘组,重症哮喘+MS组和重症哮喘+r MS-Ag85a-IL-17a组。瑞吉染色计数小鼠肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数及细胞分类计数,并测定BALF中髓过氧化物酶(MPO)活力,HE及PAS染色观察小鼠肺组织病理改变,ELISA法测定BALF及脾细胞培养上清中细胞因子IL-5、IL-6、IL-12、IL-10、IL-13和IL-17A的浓度,流式细胞术检测脾脏INF-γ+Th1细胞及IL-4+Th2细胞的含量,RT-PCR法检测肺组织中IL-6、IL-10、IL-23、Eotaxin-1、MIP-2、TGF-β、T-bet、GATA3和RORγt的m RNA表达情况。结果:(1)重组质粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a经测序及酶切鉴定正确,质粒电转化耻垢分枝杆菌获得r MS-Ag85a-IL-17a,Western blot鉴定其表达融合蛋白Ag85A-IL-17A,该融合蛋白与抗IL-17A抗体特异性结合。r MS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜免疫小鼠,可诱导产生抗IL-17A自身抗体,免疫后第1周血清中开始出现自身抗体,第3周到达峰值,有效滴度可维持4周以上。r MS-Ag85a-IL-17a降低小鼠肺组织匀浆中IL-5和IL-17A的水平,提高IL-12的水平;上调肺组织T-bet的表达。r MS-Ag85a-IL-17f未能在小鼠体能诱导产生抗IL-17F自身抗体。r IL-17F能够增强小鼠肺部炎症反应,减少肺炎链球菌在小鼠肺部的定植。(2)r MS-Ag85a-IL-17a增强巨噬细胞的吞噬功能,促进巨噬细胞的凋亡;提高巨噬细胞分泌NO、IL-6、MIP-1α及TNF-α的水平,促进细胞内IL-6、IL-10、Defb-2及i NOS的表达。(3)r MS-Ag85a-IL-17a干预哮喘小鼠模型,与重症哮喘组比较,r MS-Ag85a-IL-17a显著降低哮喘小鼠BALF中白细胞总数、嗜酸性粒细胞及中性粒细胞的数量;降低BALF中IL-5、IL-6、IL-13和IL-17A的水平,提高IL-12的水平;降低脾细胞培养上清中IL-5、IL-6、IL-13和IL-17A的水平,提高IL-12、IL-10的水平;抑制BALF中MPO的活力;抑制肺组织IL-6、IL-23、Eotaxin-1、MIP-2、TGF-β和GATA3的表达,上调IL-10和T-bet的表达;流式细胞术结果提示r MS-Ag85a-IL-17a提高小鼠脾脏INF-γ+Th1细胞数量,降低IL-4+Th2细胞数量;肺组织病理结果提示r MS-Ag85a-IL-17a干预组小鼠的气道炎症明显减轻,炎性细胞渗出及气道黏液分泌减少。结论:(1)成功构建重组耻垢分枝杆菌r MS-Ag85a-IL-17a,Western blot证实其表达融合蛋白Ag85A-IL-17A。r MS-Ag85a-IL-17a能够在小鼠体内诱导产生较高滴度的抗IL-17A自身抗体。(2)r MS-Ag85a-IL-17a加强巨噬细胞吞噬功能,促进细胞分泌炎症介质,增强巨噬细胞抗感染能力。(3)r MS-Ag85a-IL-17a经鼻腔黏膜免疫能够有效减轻小鼠气道炎症反应。