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本实验室2006年已经发现粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)核糖体蛋白RPL3202可以与含有GTTGGT的DNA序列特异性结合并能激活基于GAL4酵母杂交体系中的报道基因(Wang et al,2010)。经过分析ace2上游启动子序列含有GTTGGT的类似序列。再通过真核过表达、敲除rp13201和rpl3202基因观察细胞生长状态,得出rpl3202基因在酵母细胞生长周期中对数期表达量升高,rpl3201基因在酵母细胞生长周期中的平台期表达量上升并伴随rpl3202基因表达量下降。这些状态都与ace2基因的表达呈现一定的相关性。基因芯片的结果显示,野生型的粟酒裂殖酵母SP-Q01,从对数期到平台期sepl含量上升,而ace2的含量下降,但是在过表达RPL3201中,sepl的含量几乎没有变化,但是ace2的含量仍然下降,这说明sepl基因并不是直接作用ace2基因的。其中ace2这个基因受到rpl3202基因影响达到了2倍之多,所以推测RPL32蛋白可能是一种新型的转录调控ace2的因子。为了揭示RPL32核糖体的转录因子功能,我们首先通过启动子预测软件预测了ace2上游1000bp可能是ace2基因的启动子所在区域,含ace2上游1000bpyas56菌株半乳糖苷酶酶活性为13000nmol/(min mg),含ace2上游800bp yas56菌株半乳糖苷酶酶活性达到了20000nmol/(min mg),含ace2上游400bp yas56菌株处半乳糖苷酶酶活性也达到了19000nmol/(min mg),但是当截取ace2上游启动子到200bp时,含ace2上游200bp yas56菌株半乳糖苷酶酶活性下降至2000nmol/(min mg),从而确定ace2上游核心启动子区域为其转录起始位点上游400bp。经过生物信息学技术分析其转录起始位点上游400bp左右的启动子区域,其中发现多个与DNA复制以及有丝分裂相关的结合位点,包括PCB box、MCB box、SCB box等。其中PCB box是由GCAACG组成的DNA box(Vicky Buck1,*,2004),调控着M期细胞基因cdcl5+, spo12+, fin1+, slp1+, ace2+以及plol+的表达。为了验证RPL32蛋白调控ace2基因,我们通过酵母单杂交菌株进行的点圈实验,以及在400bp核心区域周围设计特定引物进行的Chip-PCR实验来验证RPL32同源核糖体蛋白与ace2上游调控序列的相互作用关系。首先将质粒pGADT7经过BamHI/EcoRI酶切,然后与带有BamHI/EcoRI酶切位点的rpl32基因连接形成重组表达质粒pGADT7+rpl32,同时将质粒pAbAi经过HindⅢ/XhoI酶切并与ace2上游400bp融合形成重组质粒pAbAi+400,将质粒pAbAi+400线性化导入到YIHgold菌株中形成诱饵菌株,再将质粒pGADT7+rpl32导入到诱饵菌株中形成点圈实验菌株YIHgold (pGADT7+rpl32),以菌液OD600=1为起始浓度,10倍逐级稀释菌液进行点圈,发现YIHgold(pGADT7+rpl3202)的长势与YIHgold(pGADT7)相同,而YIHgold(pGADT7+rpl3201)却比YIHgold(pGADT7)长势差,证明了RPL3201存在抑制菌株生长的特性,同时RPL3201、RPL3202与ace2上游400bp片段并不存在明显的相互作用关系。利用免疫沉淀原理进行Chip-PCR,先甲醛固定化SP-Q01(rpl3201-His/rpl3202-HA)菌株,抽提交联细胞的全蛋白液,制成细胞匀浆液,然后进行染色质超声剪切。由于菌株中RPL3202加上了HA标签,利用ProteinG beads结合含FC结构的抗体的性质,结合特异性识别HA标签的抗体,从而将RPL32蛋白和与之结合的DNA通过beads共同沉降下来。经过纯化DNA,最后进行Chip-PCR,实验结果为阴性,再次证明RPL3202蛋白与ace2上游启动子并没有直接的相互作用关系。因此,RPL32蛋白的功能还有待后续的深入研究。