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研究目的1.建立DMBA诱导的胰腺癌模型,并探讨其遗传学特征2.探讨BMSCs在胰腺癌发生中的作用3.探讨BMSCs在胰腺癌发展中的作用研究方法1.大鼠胰腺DMBA包埋3月后收集瘤样包块,评估组织病理学特征。运用PCR与DNA测序技术检测病变组织K-ras与p16突变模式。2.流式细胞术检测小鼠GFP标记的骨髓间充质干细胞(GFP-BMSCs)表面标志,在成骨与成脂培养基中培养诱导GFP-BMSCs向骨细胞与脂肪细胞分化。建立DMBA诱导的胰腺癌—GFP-BMSCs尾静脉注射模型,应用GFP免疫组化与免疫荧光激光共聚焦成像技术分析BMSCs在胰腺癌中的迁移与分布；运用导管上皮标志CK-19、胰腺星状细胞分子标志α-SMA与Desmin免疫组化与免疫荧光双染激光共聚焦成像技术分析胰腺癌组织中BMSCs的表型,并统计GFP+/CK-19+、GFP+/α-SMA+ GFP+/Desmin+亚群所占比例。3.流式细胞术检测成人骨髓间充质干细胞(HMSCs)表面标志,在成骨与成脂培养基中培养诱导HMSCs向骨细胞与脂肪细胞分化。体外试验：利用HMSCs与胰腺癌细胞直接或间接共培养计数培养后的肿瘤细胞分析HMSCS对胰腺癌细胞增殖的影响；应用过氧化氢(H2O2)诱导胰腺癌细胞凋亡,Annexin V/PI法流式细胞术检测HMSCs对胰腺癌细胞凋亡的影响。利用Transwell小室细胞迁移与侵袭试验分析HMSCs(?)胰腺癌细胞迁移与侵袭行为的影响。体内试验：建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型,接种胰腺癌细胞时共注射HMSCs,动态观察其对肿瘤生长的影响；建立胰腺癌裸鼠胰腺原位移植瘤模型,接种胰腺癌细胞时共注射HMSCs,观察脾、肝脏、肠系膜、腹膜后等部位的转移情况。收集上述模型标本,HE染色分析组织病理学特征；Masson’s trichrome染色分析HMSCs对肿瘤间质的影响;Ki-67免疫组化分析组织水平的增殖指数；TUNEL染色分析组织水平的凋亡指数。实验结果1.组织病理学诊断如下：反应性增生4例(10.26%)、胰腺上皮内瘤变26例(66.67%)、胰腺癌9例(23.07%)。K-ras基因在85.71%(30/35)的样本中扩增及测序成功,所有样本未见外显子1与外显子2点突变。P16基因在所有样本中扩增及测序成功,其总体突变率为42.86%(15/35)。突变方式均为点突变,未见同源性缺失。其中30.77%(8/26)胰腺上皮内瘤变和77.78%(7/9)胰腺癌中可检测出p16突变,两者突变率差异有统计学意义(P<0.05)。PanIN-1、PanIN-2及PanIN-3病变中p16突变率逐渐升高,分别为20.00%(1/5)、28.57%(2/7)、35.71%(5/14),三者之间差异无统计学意义。p16点突变形式包括颠换突变和转换突变。大多数样本点突变位点包含2个或2个以上的密码子。2.试验组胰腺癌实质(癌巢)与间质(致密结缔组织)中均见GFP表达,而对照组中则无表达。GFP+/CK-19+亚群占全部GFP+细胞比例为10.8±2.6%,几乎全部分布于肿瘤实质内。GFP+/α-SMA+、GFP+/Desmin+亚群比例少于5%,几乎全部分布于肿瘤间质。3. Panc-1对照组、条件培养基组、共培养组的细胞数目依次为(5.38±0.69)×104、(7.83±0.65)×104、(10.62±0.47)×104,其中条件培养基组、共培养组与对照组的细胞数目差异具有统计学意义(P<0.05；P<0.01)。Bxpc-3对照组、条件培养基组、共培养组的细胞数目依次为(15.43±0.61)×104、(24.57±1.33)×104、(38.48±1.01)×104,其中条件培养基组、共培养组与对照组的细胞数目差异具有统计学意义(P<0.05；P<0.01)。迁移试验：Panc-1、Bxpc-3条件培养基组穿膜细胞数显著多于对照组(225.6±35.0 vs.140.6±18.5,P<0.001；101.9±15.1 vs.43.6±11.5,P<0.001)。侵袭试验：Panc-1、Bxpc-3条件培养基组穿膜细胞数显著多于对照组[(101.8±16.8 vs.45.8±13.1,P<0.01；114.4±21.8 vs.49.0±11.34,P<0.01)。共注射组肿瘤体积显著大于对照组。肿瘤生长曲线示共注射组肿瘤生长速度为对照组的5倍以上(P<0.0001)。共注射组与对照组的肿瘤质量的差异具有统计学意义(0.325±0.091 vs.0.063±0.017 g,P<0.05)。移植瘤HE染色可见共注射组中出现散在的致密结缔组织,交错于肿瘤细胞之间。Masson’s trichrome染色可见共注射组中存在大量胶原纤维,与HE染色中致密结缔组织相对应。共注射组胶原纤维面积比显著高于对照组(27.1±4.3 vs.2.7±0.8%,P<0.001)。Ki-67免疫组化示共注射组增值指数显著高于对照组(68.6±8.1 vs.30.1±6.4%,P<0.01)。TUNEL染色示共注射组凋亡指数显著低于对照组(10.0±2.5 vs.2.8±0.8%,P<0.01)。共注射组在脾、肝脏、肠系膜、腹膜后的转移率都高于对照组。两者在脾及肝脏的转移率之间的差异具有统计学意义(25.0 vs.75.0%,P<0.05；25.0 vs.83.3%,P<0.05)。实验结论1.我们成功建立了DMBA诱导的胰腺癌模型。该模型中未见K-ras点突变(外显子1与外显子2),与人胰腺癌突变模式不同。而该模型中p16突变是肿瘤发展过程中的常见现象,与人胰腺癌突变模式相似。2. BMSCs迁移至DMBA诱导的胰腺癌实质与间质中,参与了实质与间质的发生BMSCs通过转分化途径参与胰腺癌的发生,很可能成为胰腺癌潜在的细胞来源。3. BMSCs通过促进胰腺癌细胞增殖、迁移与侵袭能力、间质形成以及抑制凋亡等机制促进胰腺癌的生长与转移。BMSCs在胰腺癌发展中发挥促癌作用,应用BMSCs作为载体对胰腺癌进行生物治疗的安全性有待进一步评估。