金属硫蛋白(MTs)具有多种多样的生理调节功能,包括金属动态平衡、重金属解毒、拮抗电离辐射、清除自由基以及机体生长发育、生殖衰老、肿瘤发生、免疫应激反应等各个方面,其研究涉及农业、医药保健、生物工程、环境保护等各个领域。此外,在一些物种中,MT和其蜕皮周期波动以及生殖周期具有某些相关性,在其性腺发育的不同时期体现出不同的表达量,估计可能和这些物种生物基本金属离子的代谢有关。对于金属硫蛋白的研究,国内外主要集中在提取、检测以及应用上。但是随着分子生物学技术的快速发展,MT基因克隆技术、RNA印迹技术、Genome walking技术、实时定量PCR技术应用于MT的定量检测和序列测定成为现实。甲壳动物关于金属硫蛋白的研究多集中在蛋白的提取和纯化上,关于其分子生物学方面的研究相对薄弱,在这之中大部分研究集中在cDNA的获得和表达上,而关于其基因结构和功能区分析等则很少。中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是十足目(Decapoda)方蟹科(Grapsidae)绒螯蟹属(Eriocheir)甲壳动物,其自然分布区主要在亚洲北部、朝鲜西部和中国。早在1000多年前我国就已对中华绒螯蟹的生活习性,特别是生殖洄游规律有一定的了解。近年来随蟹苗的人工培育和放流增殖,此蟹已遍布全国,是我国一种重要的经济蟹类。而近年来许多潜在的技术层面的问题也逐步暴露出来,于是,水生动物分子、遗传等层面的研究日益受到重视,中华绒螯蟹一些免疫或代谢相关的功能基因纷纷克隆出来,本研究中MT-1基因的克隆及研究将为中华绒螯蟹日后的研究提供一定的理论基础,对于在基因和分子层面研究其免疫防御机制、转基因技术等方面提供了基础研究理论。1根据E. sinensis肝胰腺cDNA文库中的EST序列分析,应用通用引物在文库中扩增获得金属硫蛋白基因(metallothionein-1, MT-1)全长579bp的cDNA序列,其ORF 180bp,编码59个氨基酸。5’和3’非编码区(untranslated regions, UTR)分别为81bp和318bp。该氨基酸序列的半胱氨酸(Cys)含量高达30.5%,并呈"Cys-X-Cys", "Cys-X-X-Cys", " Cys-X-X-X-Cys"方式排列。2运用半定量和实时定量PCR分析该基因在各个组织中的表达,发现肝胰腺中该基因的表达远远高于其他组织,大约为精巢的500倍左右；除此之外在其他组织中,精巢、胸腹神经团、肠中表达量较高,在卵巢、鳃、胃、脑、血淋巴、心脏和肌肉中表达量很低。另外,运用实时定量PCR (RealTime-PCR)对发育期各月的精巢进行定量检测,发现8月份MT-1基因表达量最高,随后递减,9月份急速下降,11月份时达到最低值,随后的两个月中,该基因表达量显著上升,说明MT-1基因可能在中华绒螯蟹精巢发育中起一定的作用。3运用Genome walking技术得到该基因全长结构。该基因由三个外显子和两个内含子构成,两个内含子长度分别为984bp和380bp,三个外显子长度分别为25 bp,78 bp和77 bp。克隆到的该基因全长为3816 bp,其中包括1735bp的5’端侧翼序列、三个外显子、两个内含子和3’端侧翼序列。分析结果显示,5’端功能区含有MRE、HNF-1、AP-1、SP1、GATA、USF及HSF等反应元件。4金属硫蛋白可能对重金属离子具有储运、代谢和解毒作用,因此用不同浓度Cu2+(0.05 mg/L,0.1mg/L,0.5 mg/L,1 mg/L)对驯养10天的中华绒螯蟹进行7天诱导处理,实时定量PCR结果显示在O.1mg/L浓度下,该基因表达量最高；0.1mg/LCu2+对驯养10天的中华绒螯蟹进行不同时间处理结果显示,随着处理时间的增加基因表达呈上升趋势,在5天时达到最高,随后递减。说明该基因可能参与了中华绒螯蟹体内Cu2+的储运和解毒代谢。本研究借助分子生物学和生物信息学的手段,首次分析E. sinensis肝胰腺cDNA文库中的EST序列,克隆到其metallothionein-1基因的cDNA全长并验证其序列准确性。在此基础上,通过Genome walking和实时定量PCR技术进一步对该基因的基因结构和表达模式进行分析,这些研究结果为了解中华绒螯蟹metallothionein-1基因的功能提供了基础资料,并为其他亚型和物种MT基因的进一步研究提供了新的思路。