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蛋白质是生命功能的执行者，生命的遗传信息最终主要通过蛋白质的方式得到表达。而蛋白质与蛋白质相互作用形成的复合物（简称蛋白质复合物）是细胞内蛋白质主要的存在形式，执行着细胞的主要功能。蛋白质是以氨基酸为基本单位按照一定顺序脱水缩合形成的聚合物，蛋白质的结构决定其功能，解析蛋白质及其复合物的结构对分子水平上阐明生命活动的基本规律具有重要的参考价值。因此，建立新型蛋白质复合物结构解析方法有助于深入了解蛋白质的作用并促进其结构和功能的研究。 YdiV是一个变异的EAL结构域蛋白，对细胞的移动性有负调节作用。YdiV蛋白的表达量受细菌群体感应分泌的自我诱导物分子的调控，并且能介导大肠杆菌两套群体感应系统的相互作用。flhDC作为鞭毛表达的主导操纵子处于鞭毛表达整个流程最上游且最先被转录和翻译，它能否顺利表达也成为其他一切鞭毛蛋白表达的前提。已有研究表明，YdiV蛋白与FlhD蛋白的相互作用能影响细菌的移动性。YdiV分子通过挤入FlhD4C2内部两个flhD亚基形成的环状结构与FlhD4C2复合物发生结合。结合YdiV蛋白以后，flhDC的转录辅助因子活性丧失，下游基因转录受限，抑制了鞭毛蛋白的表达。 EAL结构域的蛋白在溶液中通常是以二聚体的形式存在，YdiV结构的一个不对称单元中包括两个YdiV分子(MolA和MolB)，当YdiV蛋白与FlhD4C2蛋白质复合物发生相互作用时会改变YdiV的这种二聚作用。因此，研究YdiV-YdiV同源二聚体的结构，确定二聚后的结合位点，为研究YdiV与FlhD4C2作用的结合机理奠定基础。 本研究以生物化学、分子生物学、分析化学及环境毒理学为背景，结合高效液相色谱、质谱等实验技术，提出利用γ-射线照射产生羟基自由基对蛋白质复合物形成前后蛋白质氨基酸侧链进行氧化标记、联合蛋白酶解和高效液相色谱-质谱联用技术研究解析YdiV-YdiV、YdiV-FlhD复合物结构的方法。论文主要包括以下五个部分的内容: 论文第一章对蛋白质的基本资料、研究对象YdiV蛋白的基本资料、YdiV蛋白结构研究现状等作了简要概述，介绍了目前蛋白质研究的技术手段进展、发展趋势。在文献综述的基础上分析了当前蛋白质研究所面临的问题，提出了将γ-射线羟基自由基氧化标记技术、液相色谱-质谱联用技术以及分子对接技术等联合，用已知结构的YdiV-YdiV、YdiV-FlhD蛋白质复合物为研究对象，建立生理条件下水溶液中微量蛋白质复合物结构解析的新方法。 论文第二章选用与本论文研究对象分子量相当的大蛋白BSA为目标蛋白，应用光谱学方法对不同辐照条件下蛋白质信息变化的研究，优化并确定照射方案和蛋白质表面氨基酸侧链的标记技术。随着辐照剂量的增加，自由基对蛋白质的氧化程度明显增强，结合在蛋白质片段上的氧原子增加，引起氨基酸基团附近微环境发生明显改变，荧光光谱实验验证了这一点。而吸收光谱实验表明照射反应并未明显改变蛋白质的结构。通过实验我们解决了γ-射线停止照射后溶液中蛋白质继续氧化的问题，完善了时间、剂量可控的蛋白质及其复合物γ-射线样品照射羟基自由基氧化标记方法，拓宽了γ-射线辐照技术在蛋白质复合物结构解析方面的应用范围。 论文第三章解析了YdiV-YdiV二聚体的结构:对YdiV蛋白质单体及YdiV-YdiV二聚体应用上一章节中γ-射线羟基自由基氧化标记技术方法进行辐照标记，使用胰蛋白酶分别将氧化标记前后的蛋白酶解，对YdiV单体和YdiV-YdiV二聚体酶解产物进行液相色谱分离、质谱分析检测确定各多肽片段的氧化标记程度，并对同一肽段照射前后的氧化标记程度进行比较，确定氧化标记程度减小的(182-188)SFEPFIR多肽片段为YdiV-YdiV二聚体的结合部位。 论文第四章解析了YdiV-FlhD蛋白质复合物的结构，解析方法与上一章节中相似。通过胰蛋白酶特异性酶解氧化标记前后的YdiV、FlhD蛋白单体及YdiV-FlhD复合物获得酶解产物，并采用液相色谱-质谱联用技术进行定性、定量检测，比较分析氧化标记前后同一个肽在单体和复合物中氧化标记程度的变化，最终确定YdiV-FlhD蛋白质复合物的结合部位分别为:YdiV侧链中的(153-161)AVFDGLFTR、(167-176)SFIQQQITHR、(177-183)SFEPFIR多肽片段及FlhD侧链中的(238-245)MHTSELLK、(261-266)HIYDINLSYLLLAQR、(273-293)GINEEMATTLAALTLPQMVKI和(294-305)LAETNQLVCHFR片段。实验结果与已有研究报道中提供的蛋白构象模型相一致，验证了我们方法的准确性、科学性。 论文第五章对本论文的研究进行了总结，并根据个人的理解展望了该领域未来的发展趋势。 本研究丰富了蛋白质及其复合物结构解析的新方法，有利于环境污染物对蛋白质复合物结构和功能的研究，推动蛋白质复合物分子水平上污染物生物学效应评价的研究进程。