线粒体是细胞内能量代谢“工厂”,是细胞代谢的重要器官。线粒体具有半自主性,即线粒体拥有独立的DNA,从而使得线粒体蛋白受到细胞核DNA与线粒体DNA双重调控。己知99%的线粒体蛋白由细胞核DNA编码调控,需要经过在细胞质中转录、翻译形成携带特殊信号序列的前体蛋白,这些前体蛋白在细胞质伴侣蛋白的协助下,通过位于线粒体膜上蛋白输入系统,输入到线粒体特定不同区域。输入至线粒体的前体蛋白在基质伴侣蛋白作用下形成成熟蛋白,最终在线粒体呼吸链或线粒体基质中发挥作用。由此看来,骨骼肌线粒体蛋白输入系统是影响骨骼肌线粒体生物发生的重要环节,是线粒体生物发生得以顺利进行的物质保证。线粒体蛋白输入机制(PIM, Protein Import Machinery)涉及线粒体蛋白输入系统相关组件及不同线粒体蛋白输入通路的功能。其中,线粒体蛋白输入系统的组件构成非常复杂,包括线粒体外膜转移酶复合物TOM、线粒体内膜转移酶复合物TIM、线粒体基质伴侣蛋白以及细胞质中协助前体蛋白输入的伴侣蛋白等诸多组件。目的：本研究主要以PGC-1α、Bax/Bak基因为切入点,根据PGC-1α、Bax/Bak基因的不同特征,通过分别深入研究PGC-1α、Bax/Bak基因与线粒体PIM组件蛋白表达以及线粒体PIM功能的关系,探讨不同应激对线粒体PIM组件蛋白表达及功能调节的分子作用机制,一方面首次关注PGC-1α、Bax/Bak基因是否对线粒体PIM具有调节作用,另一方面揭示调节线粒体PIM的分子机制。方法：1. PGC-1α基因对骨骼肌线粒体PIM作用机制研究1)细胞水平对PGC-1α基因的基础性研究：采用C2C12肌细胞模型,对C2C12细胞进行分化,生成可收缩的成熟肌管细胞。实验主要采用急性电刺激成熟肌细胞模型以及结合使用多种特异性抑制剂：如NAC (ROS↓)、BAPTA-AM (Ca2+↓)、Compound c (AMPK↓)、BIRB796(p38↓)等。观察急性电刺激条件下,不同分子信号通路对PGC-1α基因在转录水平以及翻译后蛋白水平的调控。实验Ⅰ：分为对照组、急性电刺激组以及急性电刺激恢复组。Western Blot方法检测PGC-1α基因相关分子信号通路蛋白表达,免疫荧光法检测急性电刺激对肌管细胞内PGC-1α蛋白迁移的影响。实验Ⅱ：分为对照组、对照组+抑制剂处理组、急性电刺激组、急性电刺激+抑制剂处理组。在肌细胞内利用细胞转染技术,转染预构建的i)含小鼠PGC-1α基因启动子全序列的荧光素质粒或ii)含PGC-1α蛋白DNA全序列的荧光素质粒,荧光素酶检测法分别检测不同分子信号通路对PGC-1α基因转录活性以及辅激活转录活性的影响。2)动物水平对PGC-1α基因与线粒体PIM关系进行研究：采用PGC-1α基因敲除鼠动物模型,对比研究PGC-1α野生型及基因敲除小鼠骨骼肌线粒体PIM组件蛋白表达以及PIM功能。实验分组：PGC-1α WT组与PGC-1α KO组。Western Blot方法检测不同线粒体PIM组件蛋白表达,放射性同位素35s标记示踪法检测线粒体PIM功能。2. Bax/Bak基因对骨骼肌线粒体PIM作用机制研究动物水平对Bax/Bak基因与线粒体PIM关系进行研究：采用Bax/Bak双基因敲除鼠动物模型,对比研究Bax/Bak基因的促细胞调亡特性及非促细胞凋亡特性,Bax/Bak野生型及双基因敲除小鼠骨骼肌线粒体PIM组件蛋白表达以及PIM功能。实验分为Bax/Bak WT组与Bax/Bak DKO组。Western Blot方法检测细胞素色C释放、线粒体融裂主要蛋白表达、线粒体PIM组件蛋白表达。JC-1线粒体跨膜电位指示剂检测线粒体膜电位。放射性同位素35S标记示踪法检测线粒体PIM功能。3.骨骼肌线粒体PIM运动适应性研究动物水平对骨骼肌线粒体PIM运动适应性分子机制进行研究：采用Bax/Bak双基因敲除鼠动物,结合6周自主性跑轮运动模型,对比研究Bax/Bak野生型及双基因敲除小鼠在运动训练条件下骨骼肌线粒体PIM组件蛋白表达及功能变化。实验分为Bax/Bak WT对照组、Bax/Bak WT运动组、Bax/Bak DKO对照组、Bax/BakDKO运动组。Western Blot方法检测不同线粒体PIM组件蛋白表达,放射性同位素35S标记示踪法检测线粒体PIM功能。结果：1.急性电刺激肌细胞通过细胞内ROS/Ca2+/AMPK/p38MAPK等分子／激酶信号通路,使PGC-1α基因转录活性与辅激活转录活性各显著增高52%、35%,为其参与调节线粒体PIM组件蛋白表达提供基础。2. PGC-1α基因缺失对骨骼肌线粒体PIM组件蛋白表达的影响呈现多样性,对骨骼肌线粒体PIM功能无显著影响。3. PGC-1α基因缺失造成的细胞质环境使骨骼肌线粒体OCT输入率显著降低44%-57%。4. Bax/Bak基因缺失使凋亡诱导因素刺激下的SS线粒体、IMF线粒体细胞色素C释放量各显著降低64%、70%,其在参与线粒体途径促细胞凋亡过程中发挥重要作用。5. Bax/Bak基因缺失导致线粒体基础态、态IV膜电位各显著降低20%和16%,并使线粒体融裂蛋白表达发生变化。6. Bax/Bak基因缺失使骨骼肌线粒体PIM组件蛋白Tom40、mtHsp60以及mtHsp70表达水平均显著降低38%至40%,却使细胞质内应激蛋白Hsp90、Bip表达水平异常显著增高,导致线粒体OCT、TomO蛋白输入率分别显著降低37%与41%,线粒体基质、外膜蛋白输入通路功能严重受损。7.运动训练上调线粒体PIM关键组件蛋白Tom40蛋白表达,优化细胞质应激蛋白表达水平,使受损的线粒体PIM功能恢复至正常水平。结论：1. Ca2+、ROS、AMPK、p38等细胞分子/激酶信号通路参与电刺激诱导的PGC-1α转录水平及翻译后蛋白水平基因调控,是PGC-1α在急性应激条件下作用于线粒体PIM组件基因的分子基础。2. PGC-la基因对骨骼肌线粒体PIM的调控并非作用于对TOM、TIM组件蛋白基因的调控,而通过对细胞质、线粒体基质相关参与内质网应激(ER stress)、未折叠蛋白反应(UPR, unfolded protein response)基因的调控。3)促细胞凋亡因子Bax/Bak基因除具有促细胞凋亡特性外,还具备许多潜在的非促细胞凋亡特性,具体表现在维持线粒体膜电位、参与调节线粒体融裂以及支持骨骼肌线粒体PIM等方面。4) Bax/Bak基因对骨骼肌线粒体基质蛋白(OCT)、线粒体外膜蛋白(Tom40)输入通路均具有重要作用,其主要通过对PIM组件蛋白表达、线粒体膜电位、PIM相关伴侣蛋白表达的影响得以实现。5)运动训练对Bax/Bak双基因敲除鼠受损线粒体蛋白输入功能具有正向调节的作用,这一作用伴随线粒体PIM组件蛋白表达运动适应性上调、细胞质中应激蛋白表达运动适应性优化。提示：骨骼肌线粒体PIM具有运动可塑性,且线粒体PIM与细胞质、内质网应激(ER stress)、未折叠蛋白反应(UPR, unfolded protein response)、线粒体应激等生理过程密切相关。