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背景p53蛋白是近三十年来发现的最重要的抑癌蛋白之一。p53家族有三个成员组成，分别是p53, p63, and p73.这三个成员在结构和功能上的具有高度一致性，但分别又具有其独特的生物学功能。相比较p53而言，p63和p73主要在细胞的正常发展中起重要作用，而p53则主要是阻止肿瘤细胞的生长。这些年的研究主要集中与p53作用的蛋白上，而对于p63和p73的研究还相对较少。ASPP(apoptosis stimulating protein of p53)是近几年新发现的蛋白质家族，由三个成员组成，分别是ASPP1、ASPP2、iASPP。该家族结构的共同特点是：它们都有SH3结构域、大量的锚蛋白重复、丰富的脯氨酸结构域。ASPP1、ASPP2功能是选择性的激活p53/p63/p73的转录功能，促进凋亡基因启动子的活化，增强p53的促进细胞凋亡功能。相比之下，iASPP是p53的抑制子，通过与ASPP1和ASPP2竞争与P53结合，从而抑制P53的抑癌功能。iASPP抑制细胞凋亡的机制是通过抑制p53对凋亡基因的启动子的转录活性而抑制细胞凋亡的。但是p53功能丧失的情况下iASPP在是如何影响细胞凋亡的仍然还不清楚。为了阐明不同类型p53的肿瘤细胞中iASPP影响细胞凋亡的机制，本文利用流式细胞技术、报告基因技术、ChIP技术、抑制瘤模型等分别调查了iASPP、iASPP RNAi、p53、p63、p73等对凋亡基因转录能力的影响，探讨iASPP影响凋亡基因的转录机制，阐明p53家族的凋亡通路中影响细胞凋亡的作用因子。本文研究结果有助于了解iASPP的异常调控与肿瘤发生、发展的关系,并有望成为肿瘤治疗的新靶点。方法：1.向不同类型p53肿瘤细胞(U2OS,H1299,SW480)内中转入iASPP干扰质粒，用Annexin V-FITC方法在流式细胞仪上检测细胞凋亡的变化,用DNA ladder方法观察凋亡细胞的形态学改变。2.用CCK-8计数法观察外源性转入iASPP和将内源性iASPP干扰后，对不同类型p53肿瘤细胞增殖的影响。3.通过体外转录/翻译偶联系统分别表达iASPP、p53、p63、p73，再用免疫共沉淀和Western blot方法观察在体外iASPP与p53/p63/p73之间的相互作用。4.通过细胞转染、免疫沉淀和Western blot等技术研究iASPP对细胞内p53/p63/p73表达的影响。5.将iASPP质粒、iASPP干扰RNA质粒和Bax-Luc/Puma-Luc报告基因质粒分别转染入U2OS,H1299, SW480细胞，测定荧光素酶的荧光读数，观察iASPP对报告基因转录活性的影响。6.利用细胞转染和Western-blot技术观察iASPP干扰前后细胞内iASPP的表达变化。7.将Bax/Puma报告基因、p53质粒、p63质粒、p73质粒和对照质粒分别转染入U2OS,H1299, SW480细胞，测定荧光素酶的荧光读数，观察p53质粒、p63质粒、p73质粒对报告基因转录活性的影响。8．用染色质免疫沉淀技术研究干扰iASPP后对p63/p73和凋亡基因启动子区的DNA片断结合的影响。9.裸鼠皮下注射肿瘤细胞制备裸鼠移植瘤模型，瘤内分别注射iASPP和RNAi质粒观察肿瘤生长情况。10．用TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡。肿瘤组织制成石蜡切片后行HE染色，光镜下观察肿瘤细胞形态的改变11.以肿瘤组织的RNA为模板进行RT-PCR检测，观察对照组和干扰组中iASPP的表达变化。结果1. iASPP干扰质粒转入肿瘤细胞(U2OS,H1299,SW480)后，三种肿瘤细胞中细胞凋亡明显增加。2. iASPP转入肿瘤细胞后，肿瘤细胞增殖加快。干扰iASPP后，肿瘤细胞增殖受到抑制。3.通过体外转录系统，证实了iASPP能与p53、p63和p73结合。4.细胞实验表明，在三种不用类型p53的肿瘤细胞中，iASPP均能与p53、p63和p73结合。5.报告基因试验表明，iASPP能降低凋亡基因的转录活力。干扰iASPP后能增强凋亡基因的转录活力。6. iASPP干扰U2OS, H1299和SW480前后，三种肿瘤细胞内p53/p63/p73的表达维持不变，说明7.报告基因试验表明, p53/p63/p73能增强凋亡基因的转录活力。8. ChIP实验表明，干扰iASPP后，和凋亡基因启动子区结合的p63/p73增加。9.裸鼠试验中，瘤内注射iASPP能加快肿瘤的生长，瘤内注射iASPP RNAi能减缓肿瘤的生长。结论：1．在不同类型p53肿瘤细胞中，iASPP均能抑制细胞的凋亡，即iASPP抑制细胞凋亡的能力不仅存在于野生型p53细胞中，也存在于p53缺失和突变细胞中。2.在不同类型p53肿瘤细胞中，iASPP能促进细胞生长。3.在细胞内和细胞外，iASPP均能和p53家族的三个成员p53/p63/p73相互结合。4. iASPP能抑制前凋亡基因bax/Puma的转录活力。5. p53家族三个成员在肿瘤细胞内的表达不受iASPP的影响。6. p53/p63/p73能增强前凋亡基因bax/Pum的转录活力。7. iASPP能抑制p63/73和凋亡基因启动子结合的能力。8.用裸鼠移植瘤结果说明干扰iASPP能延缓裸鼠肿瘤的生长，证明了iASPP具有抑制p53家族成员促进肿瘤细胞凋亡功能从而使细胞增殖和恶性转化的作用，从而促进肿瘤的发生。