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作为极为重要的细胞代谢和应激反应传感器,Sirtuins(SIRT1-7)家族在繁殖上的功能日益受到研究者关注。已有证据表明SIRT2在体细胞的有丝分裂、能量代谢及衰老等方面具有重要作用,而有关SIRT2与卵母细胞成熟、老化的报道较少,其作用机制更是不明确。基于此,本研究利用小分子抑制剂、si RNA干扰、免疫组织化学、细胞免疫荧光、ELISA、RT-q PCR、Western blot和免疫共沉淀等技术与方法,解析SIRT2在牛卵巢组织和卵母细胞亚细胞的定位,及其在卵子成熟、胚胎发育和老化过程中的表达规律;揭示SIRT2对牛卵母细胞核成熟、胞质成熟和老化的作用;明确SIRT2对牛卵丘-卵母细胞间隙连接通讯和卵巢颗粒细胞类固醇激素合成的作用及其调节途径。以期系统阐明SIRT2调控牛卵母细胞成熟、老化的分子机制,为提高牛卵母细胞质量、延缓卵母细胞老化提供科学依据。本研究获得以下主要研究结果和结论:1.SIRT1-7均在牛卵母细胞中表达,其中SIRT1和SIRT2的表达水平最高。除SIRT7之外,Sirtuins家族的m RNA表达水平在牛卵母细胞老化过程中以时间依赖的方式逐渐降低。特别是在牛卵母细胞体外老化48 h后,SIRT1、SIRT2和SIRT5的基因表达水平极显著低于新鲜成熟的卵母细胞(P<0.01)。进一步研究显示SIRT2在牛卵巢颗粒细胞、卵母细胞、卵丘细胞中均高表达,并且SIRT2存在于牛卵母细胞的细胞质和核。此外,SIRT2在牛卵母细胞的减数分裂阶段表达水平最高,而在成熟后发育至囊胚阶段,其表达水平逐渐下调。这些结果表明,SIRT2可能参与牛卵母细胞的减数分裂和老化过程。2.在牛卵母细胞体外成熟培养过程中,添加5μM Sir Real2(SIRT2特异性抑制剂),几乎完全抑制了SIRT2的去乙酰化酶活性,但不影响牛卵母细胞的活力。SIRT2失活显著抑制了牛卵母细胞的核成熟和胚胎发育(P<0.05),而SIRT1失活对核成熟无明显作用。共聚焦扫描和定量分析揭示,SIRT2失活显著增加了牛卵母细胞的纺锤体/染色体缺陷,并导致α-tubulin和H4K16高度乙酰化(P<0.05)。更为重要的是,SIRT2失活通过扰乱牛卵母细胞成熟过程中皮质颗粒、内质网和线粒体等细胞器的重新分布(P<0.05),进而阻碍了胞质成熟。同时,SIRT2失活导致胞内ROS增加、ATP产生下降和线粒体膜电位降低(P<0.05),引起线粒体功能障碍。进一步分析揭示,SIRT2失活异常下调TFAM和Mfn2表达、上调DRP1表达(P<0.05),从而扰乱线粒体的生物合成和动力学。SIRT2失活通过增加Fox O3a乙酰化水平来抑制Fox O3a的核转位,进而下调Fox O3a依赖的抗氧化基因SOD2、Cat的表达(P<0.05)。这些发现证明了,SIRT2介导的去乙酰化酶活性是牛卵母细胞核和胞质成熟所必需的。3.在牛卵母细胞体外成熟过程中,抑制SIRT2的活性干扰了卵丘-卵母细胞的间隙连接通讯(P<0.05)。SIRT2失活促进了Cx43的磷酸化修饰,并上调了MEK/ERK信号途径(P<0.05)。有意思的是,SIRT2失活介导的Cx43磷酸化作用能够被MEK1/2抑制剂所抵消。同时SIRT2失活上调了MEK1/2的乙酰化水平,这表明SIRT2通过MEK/ERK信号调节Cx43磷酸化。在功能上,下调MEK/ERK信号可以部分减缓由SIRT2失活引起的间隙连接通讯闭合。进一步分析显示,SIRT2失活通过上调Cx43乙酰化水平来阻止Cx43在牛卵丘细胞膜和卵母细胞透明带上的定位。这些证据揭示了SIRT2促进牛卵丘-卵母细胞间隙连接通讯的作用可能依赖于下调Cx43的磷酸化和乙酰化修饰。4.SIRT2失活显著抑制了牛卵巢颗粒细胞的雌二醇、睾酮分泌,促进了孕酮分泌(P<0.05)。基因表达定量分析发现,SIRT2失活显著下调了ESRs、AR表达,上调PGR表达(P<0.05)。SIRT2失活或SIRT2敲低(SIRT2-KD)均显著抑制了PPARγ、LXRα和LXRβ的蛋白水平,促进了PPARα的蛋白水平(P<0.05)。免疫共沉淀分析显示,SIRT2-KD明显增加了PPARα的乙酰化水平(P<0.05),却对PPARγ的乙酰化水平无显著影响,这表明SIRT2可能通过去乙酰化途径调节PPARα的蛋白稳定性。进一步的研究发现,PPARα激活或PPARγ失活能够模仿SIRT2-KD对LXRα表达和LXRα/RXR异源二聚体形成的抑制作用。与SIRT2-KD扰乱类固醇激素合成稳态的现象类似,PPARα激活或PPARγ失活均下调了雌二醇、睾酮合成,上调了孕酮合成(P<0.05)。值得注意的是,LXRα激活可以抵消SIRT2-KD、PPARα激活或PPARγ失活对类固醇激素分泌的调节作用。LXRα激活也可以废除SIRT2-KD、PPARα激活或PPARγ失活对St AR、CYP17和aromatase表达下调,CYP11A1表达上调的作用。这些结果揭示了,SIRT2通过LXRα促进雌二醇生物合成酶的表达、抑制孕酮合成酶的表达,从而调节类固醇激素的生物合成。5.抑制SIRT2的活性显著增加了老化牛卵母细胞的激活率、胞质碎片和纺锤体缺陷(P<0.05),进而加快了牛卵母细胞的老化进程。SIRT2失活导致老化牛卵母细胞出现更高ROS水平、异常线粒体分布、低ATP产生和丢失线粒体膜电位(P<0.05),从而加重老化牛卵母细胞的氧化应激和线粒体功能障碍。随着牛卵母细胞的老化,SIRT2表达也显著降低(P<0.05)。同时,SIRT2的表达下调或活性抑制均异常上调了牛卵母细胞的自噬水平(P<0.05)。通过早期细胞凋亡分析发现,牛卵母细胞的老化伴随着细胞凋亡,抑制SIRT2的活性增加了老化卵母细胞的凋亡率(P<0.05)。进一步研究揭示,SIRT2失活或自噬异常上调均显著增加了老化卵母细胞的caspase-3活性(P<0.05),而自噬下调可以缓解SIRT2失活对caspase-3活性的促进作用。这些结果表明SIRT2下调是牛卵母细胞老化的一个关键机制。综上,SIRT2通过对α-tubulin、H4K16和Fox O3a等靶蛋白去乙酰化作用,调节牛卵母细胞减数分裂过程中纺锤体形成、染色体排列、线粒体功能和氧化还原稳态,进而促进核和胞质成熟。此外,SIRT2通过调节Cx43的乙酰化和磷酸化修饰,促进牛卵丘-卵母细胞间隙连接的通讯,并通过PPARs/LXRα途径刺激牛卵巢颗粒细胞雌二醇的分泌,从而参与牛卵母细胞的发育与胞质成熟。老化诱导的SIRT2下调导致纺锤体缺陷、氧化应激和线粒体功能障碍,进一步加速了牛卵母细胞的老化进程,并过度激活自噬诱导的细胞死亡。这些发现最终阐明SIRT2在牛卵母细胞的发育成熟和老化过程中的生物学功能。