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细胞自噬是真核细胞降解和回收细胞内大分子物质或细胞器,维持细胞代谢需要和细胞器更新的过程,在生物体中具有重要的生理意义。电离辐射可导致细胞内线粒体受损和活性氧（reactive oxygen species,ROS）升高,诱发细胞自噬,介导细胞保护或毒性功能,对细胞稳态和存活产生影响。细胞自噬和ROS的效应机制是近年的研究热点。微管相关蛋白1轻链3B（microtubule-associated protein 1 light chain3B,MAP1LC3B/LC3B）蛋白来源于哺乳动物细胞,可促进自噬体的形成和成熟等,具有调控细胞自噬的作用,是细胞发生自噬的重要标志物。研究LC3B蛋白的构象及ROS的影响,将有助于了解辐射/ROS诱导细胞自噬的作用机制。定点自旋标记-电子顺磁共振（site directed spin labeling-electron paramagnetic resonance,SDSL-EPR）技术能检测生物大分子的运动性和动态结构特征,具有不受分子量限制和溶液状态下检测等特点,是目前研究生理状态下蛋白质结构与运动的重要方法之一。利用SDSL-EPR技术获得生理环境下感兴趣氨基酸位点处及其周围的构象特征,将有助于揭示蛋白质相互作用的分子机制。蛋白质分子的结构及其构象变化与其特性和功能密切相关,在溶液状态下获得蛋白质分子的结构信息对探索其在生理状态下的相互作用机制更具有实际意义。目前,LC3B蛋白的功能研究已较为深入,但其生理状态下的结构及构象动态变化仍不清楚。为实现利用SDSL-EPR技术研究溶液状态下LC3B蛋白的功能和结构关系,并为探讨ROS调控细胞自噬的分子机制奠定基础,本工作主要围绕体外构建LC3B蛋白点突变体实验模型和对其确定位点进行定点自旋标记及构象分析开展实验研究。方法:（1）构建LC3B-I点突变蛋白模型:参照LC3B蛋白晶体结构,在其功能活性区域设计单/双半胱氨酸（Cysteine,Cys）突变位点;以野生型的人源LC3B基因为模板,重叠延伸PCR（sequence overlap extension PCR,SOE-PCR）技术引入Cys点突变,克隆至p ET-22b原核表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）表达,并通过STREP柱亲和层析纯化;鉴定蛋白活性,筛选出不影响蛋白生物活性的突变位点。（2）体外构建LC3B-II点突变蛋白模型:利用p ET28a-ATG3载体,转入BL21（DE3）原核表达E2样酶ATG3,通过镍柱亲和层析纯化;构建带有HIV-1病毒编码的反式转录激活因子（Trans-activator transduction,Tat）核心肽段（GRKKRRQRRR）的p ET28b-Tat-ATG7载体,转入BL21（DE3）融合表达E1样酶ATG7,通过镍柱亲和层析纯化;优化ATP、脂质体和各配体蛋白浓度以及混合温育条件,体外构建LC3B-II突变蛋白体;密度梯度离心纯化LC3B-II突变蛋白。（3）ROS对LC3B蛋白的影响:MTSL标记LC3B-I突变蛋白,加入终浓度为50～1000u M的H2O2,检测LC3B-I蛋白不同位点于H2O2作用前后的EPR波谱;在体外构建LC3B-II蛋白的体系中加入不同浓度H2O2,检测LC3B-II蛋白的体外构建效率;运用基于Easy Spin程序包的波谱拟合软件解析波谱不同成分及其运动性参数,获得LC3B蛋白构象运动性指标。结果:（1）在LC3B蛋白的HP1和HP2结构域周围,以及α1螺旋和NHD结构域上设计了一系列单/双Cys突变位点,表达和纯化了LC3B-I突变体蛋白,实现了可溶性LC3B-I突变蛋白模型的构建。（2）构建了p ET28b-Tat-ATG7载体,解决了ATG7蛋白原核表达以包涵体形式存在难以溶解的问题,实现了LC3B-I转变LC3B-II过程中关键辅助蛋白ATG3和ATG7的高效可溶性原核表达和纯化;建立了体外构建LC3B-II突变蛋白模型的体系并获得了纯化的LC3B-II蛋白。（3）实现了LC3B-I蛋白选定位点的定点自旋标记及其运动相关性分析,初步获得了溶液状态下LC3B-I蛋白选定位点的构象信息,预示溶液状态下LC3B蛋白功能结构域的同一氨基酸位点处可能存在2-3种不同的构象特征。（4）一定浓度的ROS对LC3B-I蛋白的现有突变位点处构象以及LC3B-II蛋白的体外构建效率影响均不明显。结论:本课题工作首次尝试采用SDSL-EPR技术研究了溶液状态下细胞自噬相关蛋白LC3B分子上特定位点的构象特征,初步研究结果为从LC3B蛋白的角度了解细胞自噬的机制提供了参考,也为进一步深入研究LC3B蛋白调控自噬的结构基础与作用机制奠定了基础和提供了适用的新技术手段。