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目的:构建靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的RNA干扰（RNAi）真核表达载体和PUMA基因的真核表达载体,探讨hTERT蛋白和PUMA蛋白在MCF-7细胞中表达的相关性及hTERT基因干扰和外源性PUMA基因联合作用促MCF-7细胞凋亡的可能机制,为hTERT基因干扰和外源性PUMA基因联合作用作为肿瘤基因治疗策略的应用提供依据。方法:根据hTERT基因的RNA干扰靶序列GGAACACCAAGAAGTTCATCT,设计合成具有该靶序列短发夹结构的寡核苷酸,退火形成双链DNA,并定向克隆到真核表达载体pYr-2.1-hU6形成重组质粒pYr-2.1-hTERT-shRNA。将重组质粒转化感受态细胞DH5α,经Kanar抗性筛选和CCDB致死基因筛选,挑选阳性克隆菌落进行摇菌扩增,并抽提纯化质粒,然后将抽提的重组质粒进行SacI酶切和琼脂糖电泳分析,同时做测序鉴定以确定插入的干扰片段准确无误。同法构建不针对任何基因的shRNA阴性对照质粒pYr-2.1-HK。将PUMA基因序列（gene bank NM014417）克隆入质粒pYr-ads-1,构建PUMA真核表达质粒pYr-ads-1-PUMA,转化感受态细胞DH5α,经Kanar抗性筛选,挑选阳性克隆菌落进行摇菌扩增,并抽提纯化质粒,然后将抽提的重组质粒进行BamHI和EcoRI双酶切和琼脂糖电泳分析,同时做测序鉴定以确定插入的PUMA基因片段准确无误。用表达绿色荧光蛋白（EGFP）的质粒pYr-2.1-EGFP和表达红色荧光蛋白（RFP）的质粒pYr-ads-1-RFP检测MCF-7细胞的转染效率。实验设6个组:空白对照组、hTERT阴性对照组、PUMA空载体对照组、pYr-2.1-hTERT-shRNA组、pYr-ads-1-PUMA组、pYr-2.1-hTERT-shRNA/pYr-ads-1-PUMA组,前五组分别以每孔脂质体10μl、质粒4μg配成转染复合物,加入各组MCF-7细胞中进行转染（空白对照组不加任何试剂）,联合组每孔pYr-2.1-hTERT-shRNA和pYr-ads-1-PUMA各4μg,脂质体20μl。于转染后48h裂解各组细胞提取总蛋白,通过Western blot检测各组细胞hTERT、PUMA、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达。结果:1.重组质粒pYr-2.1- hTERT-shRNA经SacI酶切鉴定和测序鉴定证实目的序列已准确插入到预计位点,重组质粒构建成功。2.重组质粒pYr-ads-1-PUMA经BamHI和EcoRI双酶切鉴定和测序鉴定证实目的序列已准确插入到预计位点,重组质粒构建成功。3.转染后48h荧光显微镜下观察,根据发荧光的MCF-7细胞所占比率判断LipofectamineTM 2000转染MCF-7细胞的转染效率约60%。4.免疫印迹Western blot分析显示:pYr-2.1-hTERT-shRNA组和pYr-2.1-hTERT-shRNA/pYr-ads-1-PUMA联合组hTERT蛋白的相对表达量与三个对照组相比均下降约52%,差异具有统计学意义（P<0.05）,与pYr-ads-1-PUMA组相比下降约53.5%,差异具有统计学意义（P<0.05）,而pYr-2.1-hTERT-shRNA组与pYr-2.1-hTERT-shRNA/pYr-ads-1-PUMA联合组之间hTERT蛋白表达差异无显著性（P>0.05）,pYr-ads-1-PUMA组与三个对照组相比hTERT蛋白表达差异无显著性（P>0.05）;pYr-ads-1-PUMA组和pYr-2.1-hTERT-shRNA/ pYr-ads-1-PUMA联合组PUMA蛋白的相对表达量与三个对照组相比均增加约145.3%,差异具有统计学意义（P<0.05）,与pYr-2.1-hTERT-shRNA组相比增加约147.7%,差异具有统计学意义（P<0.05）,而pYr-ads-1-PUMA组与pYr-2.1-hTERT-shRNA/pYr-ads-1 -PUMA联合组之间PUMA蛋白表达差异无显著性（ P>0.05 ）,pYr-2.1-hTERT-shRNA组与三个对照组相比PUMA蛋白表达差异无显著性（P>0.05）;pYr-2.1-hTERT-shRNA组和pYr-2.1-hTERT-shRNA/pYr-ads- 1-PUMA联合组Bcl-2蛋白的相对表达量与三个对照组相比均下降约25.1%,差异具有统计学意义（P<0.05）,与pYr-ads-1-PUMA组相比下降约24.6%,差异具有统计学意义（P<0.05）,而pYr-2.1-hTERT-shRNA组与pYr-2.1-hTERT-shRNA/pYr-ads-1-PUMA联合组之间Bcl-2蛋白表达差异无显著性（P>0.05）,pYr-ads-1-PUMA组与三个对照组相比Bcl-2蛋白表达差异无显著性（P>0.05）;pYr-2.1-hTERT-shRNA组和pYr-2.1-hTERT- shRNA/pYr-ads-1-PUMA联合组Bax蛋白的相对表达量与三个对照组相比均增加约46.1%,差异具有统计学意义（P<0.05）,与pYr-ads-1-PUMA组相比增加约45.2%,差异具有统计学意义（P<0.05）,而pYr-2.1-hTERT- shRNA组与pYr-2.1-hTERT-shRNA/pYr-ads-1-PUMA联合组之间Bax蛋白表达差异无显著性（P>0.05）,pYr-ads-1-PUMA组与三个对照组相比Bax蛋白表达差异无显著性（P>0.05）;pYr-2.1-hTERT-shRNA组、pYr-ads -1-PUMA组、pYr-2.1-hTERT-shRNA/pYr-ads-1-PUMA联合组Caspase-3蛋白的相对表达量与三个对照组相比均下降,各分别下降约23%、43.3%、62.4%,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.成功构建了hTERT基因的shRNA表达载体pYr-2.1-hTERT-shRNA和PUMA基因真核表达载体pYr-ads-1-PUMA,前者可有效抑制MCF-7细胞中hTERT蛋白表达,后者可明显提高PUMA蛋白表达,但hTERT蛋白和PUMA蛋白之间无表达相关性。2. hTERT干扰通过下调Bcl-2,上调Bax,活化Caspase-3酶原经线粒体途径诱导MCF-7细胞凋亡。3. PUMA基因通过活化Caspase-3酶原经线粒体途径诱导MCF-7细胞凋亡。4. hTERT基因干扰和外源性PUMA基因联合作用在活化Caspase-3蛋白上具有协同作用,理论上可更有效地诱导MCF-7细胞凋亡。