放射治疗是胸部肿瘤的主要治疗手段之一。虽然放疗剂量的增高有助于肿瘤的局部控制与提高患者生存率,然而,由于在放疗过程中正常肺组织不可避免的受到照射,随放疗剂量的升高,放射性肺损伤的发生率与程度也将增加。急性期放射性肺损伤是在放疗后3个月内可能出现的急性并发症；3个月后,胸部放疗患者又面临着发生晚期并发症放射性肺纤维化的可能。放射性肺纤维化主要由损伤后持续炎症所致的过度修复产生,其特征是大量炎性因子、细胞因子和趋化因子的持续分泌所致的细胞外基质,包括透明质酸、纤连蛋白、蛋白聚糖、以及胶原蛋白等的积聚。本课题组前期为了筛选出预测放射性肺损伤的蛋白,对放疗前患者的外周血进行了蛋白组学分析,对比放射性肺毒性(radiation-induced lung toxicity) RILT>2级与RILT<2级患者的血清蛋白分析结果发现,玻连蛋白在RILT≥2级患者血清中基础表达水平显著高于RILT<2级患者的表达水平(P=0.02),提示玻连蛋白的基础表达量升高与放射后的肺损伤相关,玻连蛋白可能扮演促进放射性肺损伤发生发展的角色。此外,许多学者也发现玻连蛋白在其他病因所致肺间质纤维化病人的外周血或肺内含量增加,提示玻连蛋白作为肺纤维化产生调节因子的可能。本实验先对体外培养肺成纤维细胞采用不同剂量137Cs照射后,观察照射后不同时间点不同细胞株中玻连蛋白及胶原蛋白的表达变化,选择出可致成纤维细胞辐照损伤的最佳实验条件。随后,我们进一步构建了玻连蛋白过表达及干扰的慢病毒载体；以对成纤维细胞进行玻连蛋白表达调控,从而观察在不同玻连蛋白表达水平中成纤维细胞辐照损伤程度的改变；最后,在C57BL小鼠体内通过玻连蛋白调控慢病毒构建不同玻连蛋白基础表达水平的小鼠,从而观察小鼠胸部辐照照射后放射性肺纤维化程度改变与玻连蛋白表达水平间的关系。目的分析不同剂量照射后成纤维细胞中玻连蛋白及胶原蛋白表达改变及其时间变化规律,初步探讨玻连蛋白作为辐射损伤指标的意义；构建玻连蛋白基因过表达及干扰的慢病毒载体,并转染肺成纤维细胞,检测玻连蛋白在其中的表达水平,为进一步探讨该基因的功能提供研究工具和试验基础；研究不同基础玻连蛋白表达量的肺成纤维细胞在辐照照射后发生纤维化的程度,探索玻连蛋白对纤维化过程调控通路的影响；通过慢病毒载体调控C57BL小鼠玻连蛋白基础表达量,并研究不同玻连蛋白基础表达量小鼠间放射性肺纤维化的程度改变。材料与方法采用137Cs辐射源,对人胚肺成纤维细胞WI-38和IMR-90各照射0、4、6、8、10和12 Gy,并于照后6、12、24、36、48和60 h收集细胞及培养上清液,采用Western Blot法检测玻连蛋白和胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ含量,并采用Real-time PCR法及ELISA法分别检测玻连蛋白在转录水平及细胞培养上清中的表达量。玻连蛋白过表达慢病毒的构建,通过PCR扩增玻连蛋白基因后插入到pCDH载体,通过菌落PCR初步筛选、双酶切和测序鉴定构建的pCDH-VTN重组载体和包装质粒采用脂质体共转染法转染293T细胞包装慢病毒液制备；玻连蛋白干扰慢病毒的构建,先设计合成3个针对玻连蛋白基因干扰位点的shRNA序列,插入pLVX载体,构建玻连蛋白干扰慢病毒。所构建的过表达及干扰慢病毒分别转染至W1-38细胞中,采用实时定量PCR及Western Blot检测玻连蛋白的相对表达,并筛选出干扰效率最强的干扰慢病毒。分别使用玻连蛋白过表达病毒、玻连蛋白干扰慢病毒及GFP病毒载体转染WI-38细胞,稳定转染后予8 Gy 137Cs单次辐照,照射后48 h测定各组细胞中玻连蛋白、胶原蛋白及纤维化过程相关调节通路蛋白,探索玻连蛋白基础表达量对于辐照损伤程度的影响。将玻连蛋白过表达慢病毒、玻连蛋白干扰慢病毒、空载慢病毒(阴性对照)或生理盐水通过尾静脉注射入C57BL小鼠,构建不同玻连蛋白基础表达水平的小鼠模型。给药48 h后使用6 MV直线加速器对小鼠胸部予以12Gy单次照射,构建放射性肺纤维化的动物模型,分别在照射后8周与12周处死小鼠,取小鼠肺组织,通过H.E.染色镜下观察、实时定量PCR、ELISA和Western Blot方法定性及定量地评估不同玻连蛋白表达组小鼠放射性肺纤维化发生的程度。结果1. Western Blot结果显示,受照射后两种成纤维细胞照射后玻连蛋白及胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ表达呈正相关性(r=0.40～0.79,P<0.05),都显著高于未经照射的对照组(t>3.04,P<0.05),且照射剂量与时间对蛋白的影响均呈现先增高后降低的变化趋势。玻连蛋白与胶原蛋白在8-10 Gy照后48 h,表达量最高(t>2.92,P<0.05)。Real-time PCR结果与ELISA结果显示,玻连蛋白mRNA表达及上清中含量受照射剂量影响较显著(F=27.09-42.62,P<0.05),而受时间影响较小。2.玻连蛋白过表达慢病毒pCDH-VTN转染WI-38细胞后玻连蛋白mRNA及细胞内蛋白表达水平均明显增高(t=13.49,P<0.05)。在所设计的3个针对玻连蛋白基因干扰位点的慢病毒中,对玻连蛋白表达的抑制效果最强的干扰慢病毒对玻连蛋白mRNA表达的抑制与阴性对照组相比可达75%(t=50.1,P<0.05)。所包装过表达及干扰慢病毒经浓缩后滴度测定均为1×107TU/ml以上。3.在照射后,玻连蛋白过表达组成纤维细胞中胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ细胞内及上清中含量较对照(空病毒)组明显升高(P<0.05)；同时,所检测调控网络蛋白mRNA表达量及蛋白磷酸化水平亦有明显增高；相反,在玻连蛋白干扰组成纤维细胞中胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ较对照组明显降低(P<0.05),而所检测调控网络蛋白mRNA表达量及蛋白磷酸化水平明显降低。4.对小鼠全胸进行单次12 Gy照射后8-12周,玻连蛋白过表达组小鼠肺组织中胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、羟脯氨酸、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及转化生长因子β1(TGF-β1)含量均较对照组(GFP)显著增高(P<0.05),镜下观察肺组织纤维化程度增加；玻连蛋白表达抑制组小鼠肺组织中胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ、羟脯氨酸、α-SMA及TGF-β1含量较对照组显著降低(P<0.05),镜下观察肺组织纤维化程度降低。结论1.137Cs照射后成纤维细胞中玻连蛋白在细胞内、上清中及mRNA表达水平与胶原蛋白Ⅰ、Ⅲ含量呈正相关。而8Gy 137Cs照射及照射后48 h是探讨照射后成纤维细胞放射性损伤的较优体外实验条件。WI-38更适合于做辐射损伤体外实验的细胞。2.玻连蛋白过表达及干扰慢病毒表达载体构建成功,转染WI-38细胞后分别可有效地升高和抑制的玻连蛋白表达水平。3.通过调节玻连蛋白的表达可影响体外培养成纤维细胞辐射损伤的改变,提示该蛋白是辐射损伤的关键蛋白。TGF-β1、P13K、AKT1、ERK1和JNK等蛋白也参与了辐射损伤过程。4.由慢病毒载体介导的小鼠体内高玻连蛋白表达水平会导致更严重的放射性肺纤维化产生,而由玻连蛋白干扰慢病毒介导的小鼠体内玻连蛋白表达抑制可起到缓解放射性肺纤维化的作用。