西瓜枯萎病菌侵染西瓜根系的组织病理学观察及致病相关基因Fove1的功能研究

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:mhappy
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由尖孢镰孢菌西瓜专化型引起的西瓜枯萎病是西瓜生产上危害最严重的病害之一。为进一步研究其致病机理,本研究以西瓜枯萎病菌FO1022为受体菌株,优化了其原生质体的制备条件,通过PEG介导进行了hph和gus基因的共转化,并对转化子的生物学特性以及转化子中gus基因表达活性进行了研究。结果表明:以0.8 mol/L的NaC1为渗透压稳定剂,10 mg/mL溶壁酶酶解3小时可以释放出2.48×108个/mL原生质体,两个基因共转入受体菌株的效率为40%以上。对转化子进行gus基因PCR检测和活性表达检测表明该基因已转进西瓜枯萎病菌基因组中,并能在转化菌株中表达。在PDA培养基上继代培养7代后,所有转化子仍能稳定表达gus活性。接种西瓜植株后,通过染色观察可以清晰的观察到转化子对不同抗性水平西瓜品种的侵染差异。  利用蘸根接种法鉴定西瓜枯萎病菌FO1022生理小种类型,并用绿色荧光蛋白(GFP)基因标记该菌株,观察病原菌侵染西瓜根茎系的组织学过程。结果表明,该菌株为西瓜枯萎病菌生理小种1号。用GFP标记的病菌接种感病西瓜品种‘苏蜜1号’,接种后2天,显微观察显示病原菌的分生孢子附着于西瓜根系表皮细胞并萌发,沿细胞间层定殖生长;接种后5天,在西瓜根部维管束导管中观察到大量菌丝和大型分生孢子,在根部表皮细胞上观察到大量厚垣孢子,在茎部部分维管束导管中也观察到少量的菌丝,此时48.6%的幼苗表现萎蔫症状;接种后9天,茎部所有维管束导管都充斥着密集的菌丝体,此时91.7%的幼苗表现枯萎和死亡。与侵染感病品种相比,该菌株在侵染中抗品种和高抗品种时,在侵染时间上要明显滞后。  利用融合PCR制备Fove1基因的同源重组片段,通过PEG介导的原生质体转化法将Fove1基因的同源重组片段转入西瓜枯萎病菌FO1022菌株中,得到Fove1基因的敲除突变体△Fove1和回复突变体△Fove1+Fove1,通过对FO1022、△Fove1和△Fove1+Fove1三个菌株进行菌落、菌丝和分生孢子形态以及致病力与次生代谢产物产量进行比较研究了Fove1基因的功能。结果表明,Fore1基因敲除后气生菌丝显著减少;菌丝分枝增多;分生孢子变得狭长,孢子产量显著增加;厚垣孢子产量显著降低;几乎丧失产色素的能力;致病力显著降低;影响次生代谢产物的形成(镰刀菌酸、白僵菌素等)。把Fore1基因回复后,这些差异全部消失。以上结果说明这些差异是由于Fore1基因的缺失导致的而不是由于转化片段的随机插入导致的突变。
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