成釉细胞瘤(Ameloblastomas，ABs)是发生于颌骨内的牙源性上皮来源的肿瘤，在中国，其发生约占牙源性肿瘤的36％。肿瘤内主要含成釉器样结构，但无釉质或其他牙体硬组织形成。大多数肿瘤发生于颌骨内，常导致颌骨的膨大和面部变形。虽属良性肿瘤，但其生长具有局部侵袭性，术后复发率较高，也有恶变甚至远处转移的少量报道。WH02005年新分类将ABs分为4种临床病理行为不同的变异型，包括：实性/多囊型、骨外/外周型、促结缔组织增生型和单囊型。这些亚型在患者年龄、部位、影像学表现以及临床预后等方面均存在差异，以往对于其治疗多采用刮除术，由于其复发机率较大，所以目前多以扩大切除术为主，但仍有小部分患者有复发倾向。鉴于本病至今没有有效的治疗方法，因此研究其发病机制，寻找抑制肿瘤新的靶点，对预防和治疗本病有着较重要意义。目前对ABs有较多的研究，对其分子生物学方面发病机制的探讨也不断有报道，由于其是与牙齿发育有关的肿瘤，而Wnt信号通路又是牙齿发育过程中所必不可少的信号调节通路，因此推测此通路可能与ABs发生有一定相关性。我们前期通过一系列实验检测了ABs中Wnt信号通路的下游因子表达情况，原位杂交方法结果显示c-myc，cyclin D1 mRNA在ABs中有较强表达，并且伴随其复发和恶变，其阳性表达率逐渐上升；免疫组化方法显示VEGF，mmp7在ABs中均有较高的阳性表达率。通过这些实验证实了Wnt信号通路在ABs发生中确实发挥着重要作用。而β-catenin是Wnt信号通路的关键因子，其在胞浆内异常积聚，会使其入核与TCF/LEF结合，从而启动这些下游靶基因发生转录，导致了肿瘤发生。而第3外显子是β-catenin基因(CTNNB1)突变热点，其某些密码子(Ser33，Ser37，Thr41，Ser45)是糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)的磷酸化位点，如在这些区域发生突变常可导致β-catenin降解障碍，是其在胞浆内异常积聚的原因之一。在一些肿瘤组织中常可检测到这些位点突变，而在ABs中，目前Sekine，Kawabata，Miyake，Siriwardena，Tanahashi等共做了64例ABs CTNNB1的突变分析，然而仅有3例ABs中有CTNNB1突变报道(4.7%)，具有恶性特征的肿瘤CTNNB1未见有突变，因而认为在ABs中很少发生β-catenin突变，β-catenin的胞浆积聚很可能与其自身突变无关。有学者推测β-caterun的胞浆积聚可能是由其它分子异常所致，认为降解复合物中GSK-3p、APC、Axin的异常改变则可能是造成β-catenin异常积聚的另一原因。目前关于降解复合物的研究还较少，其中GSK-3β在ABs中情况尚未见有报道；而关于APC在ABs中表达和突变研究，研究结果不甚一致；关于AXIN2在ABs中的研究，目前仅Tanahashi做了18例ABs的AXIN2突变分析，未发现有错义突变，并认为在ABs中，不是此基因的突变导致了β-catenin核积聚。由于在发育中的牙组织，AXIN2突变可以导致少牙症的发生，这首次提出了其功能，所以我们推测其与肿瘤的发生有一定关系。所以本实验决定首先从β-catenin本身和复合物中的AXIN2入手，扩大样本量，从遗传学和表观遗传学角度来探讨ABs发生机制。　　 材料与方法：　　 30例ABs样本均来自2004年至2009年在中国医科大学口腔医院外科和病理科，新鲜手术标本-86℃冻存。诊断标准依WH02005分类标准。以牙胚和正常黏膜做对照，用Real-time PCR方法，以管家基因β-actin校正，检测ABs中β-catenin及AXIN2 mRNA表达情况；用Western-blot方法，以β-tublin做内参，检测β-catenin，磷酸化的β-catenin及AXIN2蛋白表达；扩大样本至80例用免疫组化SP法观察β-catenin及AXIN2在ABs瘤细胞内表达情况，以了解β-catenin，AXIN2基因在ABs表达情况。进一步通过PCR结合直接测序法筛查β-catenin及AXIN2基因突变情况，应用BSP测序法检测β-catenin及AXIN2基因的甲基化程度，深入探讨影响β-catenin及AXIN2基因在AB中的表达机制，进而为ABs诊断和治疗提供新的理论依据。　　 实验结果：　　 一、ABs中β-catenin和AXIN2基因mRNA表达结果　　 用Real-time PCR方法，以β-actin做内参，检测了30例ABs中β-catenin和AXIN2 mRNA表达情况。结果显示ABs中β-catenin基因表达水平比正常牙胚低0.4倍，比正常黏膜高1.24倍，AXIN2基因表达水平比正常牙胚低0.03倍，比正常黏膜低0.47倍，　　 二、ABs中β-catenin，磷酸化β-catenin和AXIN2蛋白表达结果　　 用Western-blot方法，以β-tublin做内参，检测了30例ABs中β-catenin，磷酸化的β-catenin和AXIN2蛋白表达情况。结果显示，β-catenin在ABs(0.65±0.57)中的表达明显高于正常黏膜(0.17±0.11)中的表达，具有统计学意义(P<0.05)，但在ABs和牙胚组织中的表达无明显差别(P>0.05)；磷酸化的β-catenin在ABs(0.68±0.53)中的表达明显高于正常黏膜(0.17±0.07)中的表达，具有统计学意义(P<0.05)，但在ABs和牙胚组织中的表达无明显差别(P>0.05)；AXIN2在ABs(1.15±0.93)中的表达也明显高于正常黏膜(0.28±0.11)中的表达，具有统计学意义(P<0.05)，但在ABs和牙胚组织中的表达也无明显差别(P>0.05)。在ABs的各组织类型之间，β-catenin、磷酸化的β-catenin和AXIN2蛋白表达也无明显差异(P>0.05)。　　 三、ABs中β-catenin，和AXIN2免疫组化结果　　 β-catenin在正常口腔黏膜上皮细胞膜上有完整表达，在ABs的星网状层及外周层细胞中均有表达，表达强度无明显差异。在ABs中有胞浆及胞核的异位表达，其中胞核阳性为24例(30%)，胞浆阳性为77例(96.3%)。而AXIN2在ABs中胞浆及胞核均有很强阳性表达。　　 四、β-catenin及AXIN2基因突变筛查结果　　 以正常人群做对照，用PCR结合直接测序法检测了β-catenin基因(CTNNB1)第3外显子及AXIN2全部10个外显子突变情况，结果显示，在30例样品中，仅有1例样品的CTNNB1第3外显子发生了错义突变；但AXIN2共有4例样品3外显子发生突变，分别是AXIN2-5、AXIN2-6、AXIN2-8发生了非SNP位点的错义突变，突变率为13.3%(4/30)。对照组未见有异常。AXIN2-1(marker rs2240308P50S)有12例样品发生了SNP位点的错义突变，突变率40%(12/30)。　　 五、β-catenin及AXIN2基因甲基化分析结果　　 用亚硫酸氢钠修饰后测序法(BSP)，以正常人血为对照，检测了CTNNB1启动子区-147～+145bp共292bp，34个CpG位点，结果显示，在30例ABs中，CpG5位点甲基化发生率为6.7%(2/30)，CpG6为10%(3/30)，而CpG16，CpG19，CpG21，CpG33甲基化发生率均为3.3%(1/30)；AXN2启动子区-755～-355bp共401bp，15个CpG位点，结果显示，在30例ABs中，CpG1位点甲基化发生率为37%(11/30)，CpG2发生率为90%(27/30)，CpG3为63.3%(19/30)，CpG4为30%(9/30)。对照组CTNNB1和AXIN2均未见有甲基化。　　 结论　　 1、AB中β-catenin和AXIN2基因在mRNA水平上表达下调、在蛋白质水平上表达上调，并且β-catenin、AXIN2均有胞浆及核异常表达，提示β-catenin和AXIN2基因在AB的发生和发展中发挥重要的功能。　　 2、β-catenin和AXIN2基因在mRNA和蛋白质水平表达上具有不一致性，表明β-catenin、AXIN2基因的表达存在转录后水平的调控。　　 3、AXIN2可能负反馈调节β-catenin表达。　　 4、AXIN2突变和启动子区(-755～-355bp)甲基化可能是造成AB中AXIN2基因mRNA表达下调的机制及β-catenin蛋白水平表达上调原因之一。