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目的:PD-1(Programmed death-1,程序性死亡分子1)是T淋巴细胞耗竭和功能失调的标志,T淋巴细胞表面PD-1的过高表达可能会影响其增殖能力和杀伤活性。本研究通过检测肿瘤患者PBMC(peripheral blood mononuclear cell,外周血单个核细胞)中PD-1的表达情况,分析其与肿瘤患者临床资料的相关性,验证其作为评估肿瘤患者免疫状态的指标可行性;通过体外阻断抗原特异性T淋巴细胞表面PD-1的表达,分析其对T淋巴细胞体外杀伤活性的影响,并探讨PD-1单克隆抗体与抗原特异性T细胞免疫疗法联合应用的可能性。方法:用流式细胞仪检测276例肿瘤患者及58例健康人PBMC表面PD-1的表达情况,分析PD-1分子的表达与CD3+CD8+细胞毒性T淋巴细胞和记忆性T细胞相关性,对肿瘤患者的免疫状态进行初步评估。其次从肿瘤患者外周血分离PBMC细胞,利用GM-CSF、IL-4等细胞因子培养DC(Dendritic cell,树突状细胞),同时用anti-CD3m Ab、IFN-γ、IL-2等细胞因子体外扩增培养T淋巴细胞,再将其与肿瘤抗原预激的DC共孵育,最终发展为效应性T细胞。设立实验组和对照组,实验组在培养的过程中加入抗PD-1单克隆抗体(10mg/m L)阻断T淋巴细胞表面PD-1分子的表达,对照组加入Ig G1κ同型对照抗体(10mg/m L),检测两组T淋巴细胞的增殖情况和PD-1的表达情况,同时用ELISA检测细胞培养液上清中细胞因子IL-2,IL-4,IFN-γ和TNF-a的分泌量,最后用WST-1法比较两组T淋巴细胞对三种不同的肿瘤细胞株HGC-27,SW480和CNE-2的特异性杀伤活性。结果:(1)肿瘤患者PBMC中的PD-1的表达率明显高于健康人(P<0.001),并且与胃癌患者的临床分期呈正相关(P<0.05)。(2)PD-1的表达与CD3+CD8+CTL(cytotoxic lymphocyte,细胞毒性T淋巴细胞)以及CD45RO+CD62LˉTEM(effector memory T cell,效应记忆性T细胞)的含量呈负相关(P<0.001)。(3)抗PD-1单克隆抗体阻断T淋巴细胞表面PD-1的表达后,PD-1的表达率明显下降(P<0.001),而对T淋巴细胞的增殖活性无明显影响(P>0.05)。(4)ELISA结果显示:阻断PD-1的表达后T淋巴细胞分泌的IL-2,IL-4,IFN-γ和TNF-a均明显高于Ig G对照组(P<0.001)。(5)WST-1杀伤实验显示:PD-1阻断组的T淋巴细胞对肿瘤细胞株HGC-27,SW480和CNE-2的杀伤活性均明显高于Ig G对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)PD-1在肿瘤患者PBMC中的平均表达率高于健康人,PD-1的高表达在一定程度上反映了T淋巴细胞功能耗竭的状态,通过流式检测肿瘤患者PBMC中PD-1的表达可以作为抗PD-1单克隆抗体疗效预测的指标。(2)PBMC中PD-1的表达与胃癌患者分期呈正相关,可以作为胃癌患者预后的辅助指标。(3)体外阻断肿瘤抗原特异性T淋巴细胞表面PD-1的表达可有效提高其体外杀伤活性,抗PD-1单克隆抗体与过继性T细胞联合应用有望成为肿瘤免疫治疗的新策略。