目的皮肤损伤愈合是一个复杂的过程,包括血液成分凝集、炎症反应、肉芽组织形成、新生上皮覆盖、结缔组织收缩和纤维化等过程。迷走神经递质乙酰胆碱可被非神经细胞(如角质形成细胞、内皮细胞、黑色素细胞等)合成并通过自分泌、旁分泌及内分泌等方式参与皮肤的许多基本功能,如增殖、分化、粘附和迁移,微循环,血管发生及许多免疫反应。实验表明,参与皮肤损伤愈合的中性粒细胞、单核巨噬细胞、成纤维细胞、角质形成细胞及内皮细胞等均发现非神经胆碱能系统或其组成成分。M3R (M3 subtypes of muscarinic receptor)是毒蕈碱乙酰胆碱受体的一个亚型,以往的研究表明M3R参与炎症反应和组织器官纤维化等。本研究应用免疫组织化学和Western blot技术,检测小鼠皮肤切创后损伤区及周边区各时间段M3R的表达情况,探讨M3R在皮肤损伤愈合中的作用及其在损伤时间推断上应用的可能性。实验材料与方法健康成年清洁级昆明小鼠50只,雌雄不限,体重35-40g,随机分为10组。其中9组为皮肤切创组,另一组为正常对照组,每组均为5只小鼠。乙醚气体吸入麻醉,背部剪毛处理后,常规手术消毒,在背部中央做一纵行长1.5cm皮肤全层切口,深达筋膜。分别于伤后Oh、6h、12h、1d、3d、5d、7d, 10d和14d将小鼠麻醉后脱颈椎处死,取伤口处1.5cm×1.0cm皮肤组织；正常对照组小鼠麻醉后背部剪毛,不做切创,观察14d,脱颈椎处死,取相同部位同等大小皮肤。以备HE染色、免疫组织化学染色和Western blot检测应用。应用免疫组织化学和Western blot技术检测50只小鼠皮肤切创后各时间段M3R变化情况。在显微镜×400倍下,于损伤区及损伤周边区随机选取10个视野,计细胞总数、阳性细胞数及阳性细胞率。应用Scion image软件检测各时间段的平均光密度值,测得数据用均数±标准差(x±s)表示。用SPSS13.0 for Windows进行单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果正常对照组小鼠皮肤的表皮、毛囊、皮脂腺及皮肌层中均表达M3R。皮肤切创伤后6h,可见少数多形核粒细胞有M3R表达；伤后12-24h,大量的多形核粒细胞和部分单个核细胞M3R呈阳性；伤后1-3d随着时间的延长,M3R阳性细胞主要以单个核细胞为主；伤后5-14d, M3R主要表达在成纤维细胞中。伤后0～6h,M3R阳性细胞率较低,随着伤后时间的延长,M3R阳性细胞率逐渐增加,12h达到高峰,伤后1-5d一直呈高表达状态,伤后7d M3R阳性细胞率再次达到高峰,随后逐渐下降。各时间组与相邻上组的细胞总数及阳性细胞率差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示正常对照皮肤有M3R阳性条带,皮肤切创伤后各时间段组M3R表达强度有一定规律。伤后0-12h,阳性条带逐渐增强,1d,稍有下降,3d、5d,条带变化不明显,7d, M3R阳性条带再次达到高峰,伤后10d,M3R减弱,到伤后14d, M3R阳性条带基本与正常对照组条带情况一致。除Oh与正常对照组之间平均光密度值差异无统计学意义外(P<0.05),其余各组与其相邻上组之间平均光密度值差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论1、正常对照组小鼠皮肤的表皮、毛囊、皮脂腺及皮肌层中均表达M3R。2、小鼠皮肤切创愈合过程中多形核粒细胞、单个核细胞及成纤维细胞均表达M3R。3、小鼠皮肤切创愈合过程中M3R表达的规律性变化可用于皮肤损伤时间的推断。