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桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel),隶属于双翅目Diptera、实蝇科Tephretidae、果实蝇属Bactrocera,是最具破坏性的食果害虫之一,对世界果蔬产业造成巨大经济损失。其繁殖力高、适应力强,且抗药性逐年增强,为防控带来极大挑战。诱杀是桔小实蝇的主要防控措施。其中,广泛应用的商业化诱剂的主要成分为甲基丁香酚(methyl eugenol,ME)。尽管甲基丁香酚用于桔小实蝇防控近70年,其化学感受机制至今仍不清楚。气味结合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)是昆虫嗅觉生理过程中的一类重要蛋白,它能与气味分子结合并将其运输至嗅觉神经元。尽管OBPs在昆虫嗅觉感受生理功能中起着重要作用,但现阶段关于桔小实蝇OBPs的研究中,其数量、多样性和表达模式等信息仍呈碎片化状态。因此本研究利用基因组和转录组数据鉴定桔小实蝇OBPs,将BdorOBPs注释数量扩大到49个,并参照果蝇命名系统规范桔小实蝇OBPs的命名。通过系统发育分析与多重序列比对,将BdorOBPs分为4个亚家族。利用qPCR,解析BdorOBPs在不同组织的表达谱(包括触角、足、翅及头、胸、腹的外表皮,以及脂肪体、中肠、马氏管、精巢、卵巢)。随后,利用大肠杆菌表达系统获得1个文献报道参与感受ME的OBP2(BdorOBP56f-2)重组蛋白,通过体外亲和能力检测,发现BdorOBP56f-2能与ME结合,且还能与其他气味物质结合。此外,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除BdorOBP56f-2,缺失该基因后,ME对桔小实蝇突变品系成虫引诱力下降。本研究在基因组水平上系统梳理注释桔小实蝇气味结合蛋白,利用多种技术手段证实BdorOBP56f-2参与桔小实蝇感受ME的过程。研究结果不仅丰富了对桔小实蝇气味结合蛋白生理功能的认识,为研究其他昆虫气味结合蛋白的研究提供参考,也为桔小实蝇新型诱剂的研发提供靶标和理论基础。具体研究结果如下:1桔小实蝇气味结合蛋白鉴定及不同组织表达模式解析基于桔小实蝇基因组和转录组数据,鉴定了桔小实蝇的气味结合蛋白,将BdorOBPs注释数量扩大到49个,并参照果蝇命名系统规范桔小实蝇OBPs的命名。通过系统发育与多重序列比对,将其分为Classic OBPs、Minus-C OBPs、Plus-C OBPs以及Atypical OBPs 4个亚家族。其中,33个BdorOBPs属于Classical-OBPs,4个BdorOBPs属于Plus-C OBPs,10个BdorOBPs属于Minus-C OBP,而仅2个(BdorOBP83ef和BdorOBP83cd)属于Atypical OBPs。BdorOBPs在外部表皮体段(触角、足、翅及头、胸、腹的外表皮)及内部组织(脂肪体、中肠、马氏管、精巢、卵巢)表达模式分析结果表明,结果表明共有21个BdorOBPs在触角、头部表皮和足高度表达。BdorOBP56f-1和BdorOBP47a-2在桔小实蝇腹部表皮中具有很高的转录水平。BdorOBPs在体内组织中的表达普遍低于虫体各外部组织,其中19个BdorOBPs在脂肪体中高表达,4个BdorOBPs在生殖器官中表达较高。2体外证明BdorOBP56f-2与甲基丁香酚及其他气味物质的结合能力通过大肠杆菌原核表达系统获得BdorOBP56f-2的体外重组蛋白。BdorOBP56f-2与原核表达载体PET28a构建成重组质粒,转化进入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达。大肠杆菌经超声破碎后得到粗提蛋白,蛋白经镍柱纯化后进行SDS-PAGE电泳,重组蛋白在凝胶上显示得到大小约15kDa的单一条带。随后,Western-blot进一步验证重组蛋白的特异性。利用微量热涌动技术(microscale thermophoresis,MST)分析亲和能力,结果表明BdorOBP56f-2与ME,4-Carvomenthenol及Trans-2-henxenals 3种气味物质存在结合。3探究了BdorOBP56f-2在桔小实蝇成虫中的化学感受生理功能利用CRISPR/Cas9技术敲除桔小实蝇BdorOBP56f-2。母代(G0)获得4头突变个体,与野生型杂交,F2代共出现7种突变基因型的杂合子。通过克隆测序,证实在BdorOBP56f-2靶点附近发生1-9bp不等的序列增加和缺失。将其中发生4个碱基缺失的突变品系m5-m1继代饲养用作后续生理学及行为学研究。行为学测试结果显示,与野生型相比,ME对突变品系m5-m1杂合子引诱力下降30%。但其对4-Carvomenthenol,Trans-2-henxenal的选择性无明显变化。而触角电生理测定结果显示,突变品系杂合子的触角电位反应与野生型相比无显著差异。本研究结果证实BdorOBP56f-2的确参与桔小实蝇感受ME的嗅觉过程。