论文部分内容阅读
本研究旨在通过基因重组技术构建真核表达载体,使天蚕素CecropinB基因在奶山羊乳腺上皮细胞中表达,建立抗菌肽防治哺乳动物乳腺炎的转基因技术基础。另外本研究所构建的真核表达载体含有报告基因EGFP的全部序列,其下游的调控序列两端带有限制性酶切位点,可为以后研究不同的真核基因调控序列提供方便可靠的模型。本实验从免疫的家蚕蛹中提取总RNA,反转录获得cDNA,以此cDNA为模板,PCR扩增目的基因片段,获得长为340bp的天蚕素CecropinB的DNA片段,与预期的目的片段大小一致。将天蚕素CecropinB基因片段克隆到pMD18-T载体上,经双酶切鉴定出的阳性克隆进行测序,将测序结果与GeneBank上的基因进行同源性比较、分析,结果同源性为100%。将所得的pMD18-B质粒用相应的限制性内切酶切成粘性末端,回收后与同两种酶双切的pECFP-C1质粒粘端进行连接,筛选阳性重组子,依此方法构建了真核表达载体pECFP-B。用胶原酶消化法对奶山羊乳腺上皮细胞进行了分离培养,并用免疫荧光染色法测定了乳腺上皮细胞中角蛋白18的表达,从而鉴定出分离培养的细胞为奶山羊乳腺上皮细胞。用阳离子脂质体把载体pECFP-B转入奶山羊乳腺上皮细胞,所转入的质粒中带有EGFP报告基因,能够表达荧光蛋白,在荧光倒置显微镜下可看到绿色的荧光。分别在mRNA水平上和蛋白活性水平上检测抗菌肽CecropinB的表达情况,通过RT-PCR方法和抑菌圈活性检测方法分别证明抗菌肽CecropinB可以在奶山羊乳腺上皮细胞中进行表达。本实验初步建立了抗菌肽防治奶山羊乳腺炎的转基因技术,重组质粒上还有Neo抗性基因,因此利用G418对转染后的细胞进行抗性筛选,先用高浓度(800μg·mL-1)后用低浓度(200μg·mL-1)维持,一个月后,筛选出阳性细胞株,从而证明抗菌肽B能在奶山羊乳腺上皮细胞中稳定持续表达。实验还检测了转染后不同时间抗菌肽的表达量,分别取了转染后3d、7d、14d、21d和30d细胞破碎液用平板扩散法检测生物活性,以未转染的同时期细胞做空白对照,结果表明随着时间的延长,细胞内抗菌肽的表达量也有所增加,也间接证明了CecropinB基因可以随着细胞的增殖而传代。将重组质粒pECFP-B用注射器直接注入正常奶山羊和患乳腺炎的奶山羊乳腺组织中,观察抗菌肽的表达情况,结果正常的奶山羊的乳汁对金黄色葡萄球菌有杀灭作用,而对患病的奶山羊有抑制乳腺炎发展的效果。