落叶松(Larix leptolepis)是我国北方中高山地区重要针叶速生用材造林树种,是重要的生态与经济树种。因此,加大对落叶松优良品种的繁育,具有重要意义。体细胞胚胎发生途径是它理想的繁殖方式。而在落叶松体细胞胚胎发生过程中,存在胚性不稳定、畸形胚发生率高、生根率低等问题,因此,亟需关于体细胞胚发育的研究来阐明其调控网络机制。研究表明mi R396在多个物种中具有高度保守性,它通过负调节靶基因的表达,在子叶与叶片的发育、根的生长等方面起重要的调控作用,但其在裸子植物中的功能研究却还未见报道。因此,本研究以落叶松体胚为材料,进行mi R396及靶基因growth regulating factors(GRFs)的研究,为揭示体细胞胚发育过程中关键调控机制提供理论依据。主要研究成果,具体如下:(1)从落叶松中分离克隆了mi R396靶基因La GRF1,La GRF2和La GRF3。序列分析发现皆具有两个高度保守的结构域:QLQ(Gln Leu Gln)与WRC(Trp Arg Cys),其中QLQ结构域主要参与蛋白间的相互作用,WRC结构域是DNA结合区,且在WRC的3’末端含有mi R396的结合位点。(2)q RT-PCR结果表明,mi R396与La GRFs在落叶松体胚发育中差异性表达,且呈阶段性(子叶胚时期)负相关性。从原胚团时期到晚期单胚期,二者的表达都较低,未显现明显相关性与规律性,而进入子叶胚时期后,二者呈此消彼长的负调控关系,这暗示着mi R396可能是通过调节La GRFs的表达量对落叶松子叶胚的发育进行调控。(3)将落叶松体细胞子叶胚的形态发育与La GRFs表达模式结合分析,发现子叶轮廓初现到子叶不断伸展延伸,最后至发育成熟的过程,La GRFs的表达量急剧增加,并在子叶胚中期达到峰值,之后保持在较高水平。而这一过程,子叶胚主要是增加细胞数目与增大细胞体积,横向与纵向地生长发育,因此,推测在落叶松子叶胚发育中mi R396可能通过负调节La GRFs影响子叶胚细胞的数目与大小。(4)头孢敏感度检测初步筛选出S98与S287做为转化材料,头孢浓度为600 mg/L。结合最终转化结果,确定S287可作为优良转化细胞系。(5)以S287为转化材料,建立了农杆菌介导的纸片覆盖侵染遗传转化方法,以头孢霉素浓度600 mg/L的筛选条件成功获取转基因抗性系。转基因系中pre-mi R396、mi R396的表达显著上调,La GRFs的表达显著下调,子叶轮廓不规则,子叶内部细胞大小不规则,根端组织异常,表现出低的发芽率、生根率以及高的叶片数目畸形率。(6)在落叶松体胚发育中,mi R396可能通过调节La GRFs的表达量直接或间接的影响子叶细胞分裂与分化,从而对子叶的发育与形态建立进行调控。mi R396也可能通过调节La GRFs,参与根端细胞的发育,影响体胚的生根。