研究背景放射性肠损伤是核与辐射突发事件中,伤员早期死亡的主要原因,也是临床上盆腔、腹腔或腹膜后肿瘤患者放射治疗后的常见并发症。目前国内外仍无理想的治疗手段,一旦发生,死亡率几乎百分之百。因此,研究放射性肠损伤的防治,不论在国防军事还是临床肿瘤的治疗方面均具有重要意义。放射性肠损伤发生机制十分复杂,涉及细胞死亡、干细胞损伤、免疫激活、神经调节紊乱、微循环障碍等多个方面,因而在临床上其治疗难度很大,且尚无特异性的治疗方法。基于放射性肠损伤复杂的发生机制,能否找到能干预以上多个环节的药物或靶点,便成为治疗放射性肠损伤的关键所在。维生素D受体(Vitamin D Receptor,VDR)是介导维生素D发挥生物学效应的一种亲核蛋白。过去认为VDR主要作用是调节人体钙磷代谢、促进骨质发育成熟。但近年来越来越多的研究表明,VDR作为肠道中高表达蛋白之一,在肠道功能维持、损伤修复、炎症调节、干细胞分化调控、细胞凋亡抑制等方面均发挥着十分重要的作用。因此,我们推测VDR可能在放射性肠损伤的防治中具有重要意义,而这一研究目前国内外均无相关报道。因此,本文就VDR在肠道辐射损伤中的作用进行研究,首先从动物水平明确VDR与肠道辐射损伤的关系,然后通过干预VDR的活性和调控VDR表达验证其对肠道上皮细胞(Intestinal Epithelial Cell,IEC)及肠道干细胞(Intestinal Stem Cell,ISC)辐射敏感性的影响。在此基础上,还将对下游的分子作用机制进行研究,以筛选出VDR调节细胞辐射敏感性的作用分子。主要研究内容1、观察照射对小鼠肠道VDR表达的影响以及肠道辐射损伤程度与VDR表达量的相关性。2、研究干预VDR对小鼠放射性肠损伤影响的体内研究。3、研究干预VDR和调控VDR表达对肠道上皮细胞及肠道干细胞辐射敏感性的影响。4、筛选并鉴定VDR调节细胞辐射敏感性的作用分子。主要研究方法1、电离辐射对小鼠肠道组织及细胞VDR表达的影响1)通过Western blot、VDR免疫组化检测小鼠心、肝、脾、肺、肾、肠道组织VDR表达差异。2)明确电离辐射对于肠道组织及细胞VDR表达的影响。3)对小鼠进行7Gy的γ射线照射,通过免疫组化定量VDR表达以及肠道辐射损伤程度,利用秩相关检验进一步分析两者的相关性。2、调控VDR对小鼠放射性肠损伤影响的体内研究1)酶联接免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbnent assay,ELISA)检测VDR激动剂给药后24h对于小鼠血清及肠道组织1,25-(OH)2D表达水平的影响。2)利用Western blot实验明确VDR激动剂对于小鼠肠道VDR在给药后2h、4h、6h、10h、24h、48h的激动作用。3)统计VDR激动剂给药后小鼠在7.5Gy的γ射线照射后的20天生存期。4)利用H&E及异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)右旋糖酐实验、TUNEL(Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling)免疫荧光、富含亮氨酸重复序列G蛋白偶联受体5(leucine-rich repeat-containing G-protein coupled receptor5,Lgr5+)荧光原位杂交、溴脱氧尿苷(Bromodeoxyuridine,Brdu)免疫荧光明确在7Gy的γ射线照射后,VDR激动剂对于小鼠放射性肠损伤的影响。5)利用饮食喂养方式构建缺乏/高维生素D小鼠模型,并利用ELISA法检测小鼠血清及肠道组织1,25-(OH)2D的表达水平。利用masson染色观察小鼠骨质形成情况。利用抗酒石酸磷酸酶(Tartrate Resistant Acid Phosphatase,Trap)染色观察小鼠破骨细胞形成数量。同时使用Western blot实验验证肠道VDR的表达。6)利用H&E、FITC-右旋糖酐实验、TUNEL免疫组化、Brdu免疫组化、Lgr5+荧光原位杂交、Western blot实验研究模型鼠在7Gy的γ射线照射后的放射性肠道损伤情况。7)VDR激动剂腹腔给药剂量为2μg/㎏,于给药后24h进行相关剂量照射。3、VDR对肠道上皮细胞及小肠干细胞辐射敏感性影响的体外研究1)利用CCK8实验明确VDR激动剂最佳的药物剂量。2)利用Western blot实验明确VDR激动剂对肠道上皮细胞(Modek)VDR在给药后0h、0.5h、2h、4h、8h、24h表达的影响。3)明确VDR激动剂对Modek细胞辐射敏感性的影响。克隆形成实验:照射组照射剂量分别为6Gy、10Gy;给药组给药剂量为100 n M。细胞凋亡检测:照射组照射剂量为14Gy;给药组给药剂量为100 n M;检测照射后48h细胞的凋亡水平。细胞周期检测:照射组照射剂量为8Gy;给药组给药剂量为100 n M;检测照射后8h的细胞G2M期阻滞情况。5-乙炔基-2-脱氧尿苷(5-ethynyl-2-deoxyuridine,Edu)流式细胞术/免疫荧光检测细胞增殖:照射组照射剂量为14Gy;给药组给药剂量为100 n M;检测照射后48h细胞的增殖能力。4)构建Modek细胞VDR敲低/过表达细胞系,并利用荧光实时定量PCR(Real time-quantitative PCR,RT-q PCR)及Western blot实验进行验证。5)敲低/过表达VDR对于Modek细胞辐射敏感性的作用。克隆形成实验:照射组照射剂量分别为6Gy、10Gy。细胞凋亡检测:照射组照射剂量为14Gy;检测照射后48h细胞的凋亡水平。细胞周期检测:照射组照射剂量为8Gy;检测照射后8h的细胞G2M期阻滞情况。Edu流式细胞术/免疫荧光检测细胞增殖:照射组照射剂量为14Gy;检测照射后48h细胞的增殖能力。6)明确VDR激动剂的剂量及其对于肠道干细胞在辐射后的作用。小肠类器官药物毒性筛选:类器官铺板后,检测10 n M、25n M、50 n M、100 n M的VDR激动剂对于类器官的毒性效应。体内实验:小鼠照射前24h给予2μg/㎏的Calcitriol(VD)单次腹腔注射处理。随后给与7Gy的γ射线照射,剂量率为1Gy/min。照射后8h提取肠道类器官铺板,进行培养观察并进行嗅素蛋白4(Olfactomedin 4,OLFM4)及Edu免疫荧光染色,对照组小鼠给予同等体积的PBS,处理同前。体外实验:照射前24h提取小鼠肠道类器官并铺板,随即给予25 n M的Calcitriol(VD)处理,24h后进行7Gy的γ射线照射,剂量率为1Gy/min。进行培养观察并进行OLFM4及Edu免疫荧光染色,对照组给予同等体积的PBS,处理同前。利用Western blot检测VDR调控辐射后ISC的潜在分子效应。利用类器官培养检测缺乏维生素D小鼠ISC对于辐射的敏感性。4、VDR调控肠道上皮细胞辐射敏感性的机制研究1)TRIZOL法提取Modek-VDR-SH细胞系的RNA,并利用RNA-SEQ对其进行差异基因筛选。2)对差异基因进行GO分析(Gene ontology)及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析。3)对差异基因重新聚类分析并利用RT-q PCR对差异基因进行验证。4)利用小干扰RNA(Small interfering RNA,si RNA)干扰相关差异基因观察对于辐射后Modek-VDR过表达细胞的影响,从而鉴定出VDR下游的作用分子。主要研究结果(一)电离辐射对小鼠肠道组织及上皮细胞VDR表达影响1、小鼠各组织器官中,肠道VDR丰度最高。2、电离辐射可诱导小鼠肠道组织及上皮细胞VDR的表达。3、小鼠肠道辐射损伤程度与VDR表达呈负相关性。(二)调控VDR对小鼠放射性肠损伤影响的体内研究1、VDR激动剂可减轻小鼠放射性肠损伤,抑制肠道上皮细胞凋亡,延长小鼠辐射后生存期。2、VDR激动剂能保护肠道干细胞,促进照后肠道上皮的修复。3、通过维生素D营养素摄入控制可构建缺乏/高维生素D小鼠模型。4、缺乏维生素D小鼠肠道辐射损伤加重,而高维生素D小鼠肠道辐射损伤减轻。5、缺乏维生素D小鼠照后肠道干细胞功能受到抑制,损伤修复减弱;而高维生素D小鼠照后肠道损伤修复显著加快。(三)VDR对肠道上皮细胞及小肠干细胞辐射敏感性影响的体外研究1、VDR激动剂可上调小鼠肠道上皮细胞VDR的表达。2、VDR激动剂可降低Modek和小肠干细胞辐射敏感性。3、敲除VDR增加Modek细胞辐射敏感性。4、过表达VDR可减轻Modek细胞辐射损伤。(四)VDR调控肠道上皮细胞辐射敏感性的初步机制研究1、以Modek-VDR-SH为研究对象,通过对其进行RNA-SEQ测序,我们发现敲低VDR后有232个基因下调,158个基因上调,对差异基因进行GO分析及KEGG分析。2、选取部分差异基因进行验证,RT-q PCR结果与测序结果相一致。3、构建差异基因si RNA,发现干扰丙酮酸脱氢酶激酶1(Pyruvate Dehydrogenase Kinase 1,PDK1)及缺氧诱导因子2α(hypoxia-inducible factor 2α,HIF2α)后能逆转过表达VDR所诱导的肠道上皮细胞辐射敏感性的下调。研究结论电离辐射可诱导小鼠肠道组织VDR的表达,而激动或上调VDR表达能减轻小鼠肠道辐射损伤,降低肠上皮细胞辐射敏感性,保护肠道干细胞功能,促进照后肠道上皮损伤修复。VDR对肠道的保护作用可能是靶向HIF/PDK1通路而实现的。