产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)属于致病性大肠杆菌的一种,常因食物及水源的污染而引发人和动物的感染,特别是在初生动物中有很高的发病率、死亡率,制约了养殖行业的发展,同时威胁了人类的健康。研究发现,其主要致病因子是肠毒素和黏附素。Etp A属于黏附素中的一种,分子量较大,能与肠上皮细胞上的特异性受体结合,在细菌和肠壁之间形成分子桥,介导ETEC的黏附。EtpA在不同血清型的ETEC中表达高度保守,同源性很高。另有实验证实,Etp A具有良好的免疫原性,能够有效阻止ETEC对肠道上皮细胞的黏附。这一发现为预防ETEC引起的动物腹泻,开拓了新的思路。为了降低由ETEC造成的经济损失,减弱ETEC对动物健康的损害,在寻找有效的预防办法的同时,提高动物的免疫功能也至关重要。动物肠道面积巨大,其中聚居着数量庞大的微生物菌群称为肠道菌群;肠道黏膜还拥有丰富的免疫细胞及免疫分子,参与构成机体抵御病原微生物侵入的肠道黏膜免疫系统。其中有益菌群的增加能调节肠道菌群结构的稳定性,丰富菌群多态性,促进肠道黏膜生长,刺激肠黏膜分泌免疫分子,提高肠道黏膜免疫功能,帮助机体抵御病原微生物的侵袭。酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)是酵母菌科(Saccharomycetaceae),酵母菌属(Saccharomycodes)的成员,属于益生菌的一种。在研究其益生作用时发现,它含有丰富的营养物质和未知生长因子,能提高动物的生产性能,促进肠道黏膜发育,增加有益菌群的数量,增强肠道黏膜免疫功能。本课题组通过基因克隆、同源重组等技术,使大肠杆菌黏附素Etp A在酿酒酵母菌中高效表达,成功构建出Etp A酵母工程菌。并在细胞实验中发现,Etp A酵母工程菌能有效阻止ETEC对肠上皮细胞的黏附,具有保护上皮细胞的作用。本研究在此基础上进行了以下实验:1.本研究选取断奶日龄21d的SPF级健康SD大鼠120只,雌雄各半。随机分为3组:空白对照组、酿酒酵母菌组(以下简称为酿酒酵母组)、Etp A酵母工程菌组(以下简称为Etp A组),每组40只,雌雄各半。实验期间分别给3组大鼠灌服生理盐水、107 CFU/mL酿酒酵母菌菌液、107 CFU/mL Etp A酵母工程菌菌液,每天1次,每次2mL/只,共持续28d;然后连续3d灌服108 CFU/mL大肠杆菌(H10407)菌液,每天1次,每次5mL/只。分别于实验第7、14、21、28d和结束灌服大肠杆菌菌液3d后,取各组大鼠粪便。通过末端限制性片段长度多态性(t-rflp)、实时荧光定量pcr、ph值检测技术,研究了etpa酵母工程菌对肠道菌群otu(微生物可操作单元)和ph值的影响,以及对肠道重要菌群:类杆菌(bacteriodes)、梭菌(clostridium)、肠球菌(enterococcus)、双歧杆菌(bifidobacterium)、乳杆菌(lactobacillaceae)数量的影响。2.本研究分别于实验第7、14、21、28d和结束灌服大肠杆菌菌液3d后,采集大鼠十二指肠、空肠、回肠组织。通过组织切片观察、酶联免疫吸附实验(elisa)、实时荧光定量pcr技术研究了etpa酵母工程菌对十二指肠、空肠、回肠绒毛长度、宽度、肠隐窝深度、绒毛长度/隐窝深度(v/c)的影响;对肠道黏膜中重要免疫分子:分泌型免疫球蛋白a(siga)、白介素-2(il-2)、白介素-4(il-4)及干扰素-γ(ifn-γ)分泌量的影响。实验结果如下:1.etpa酵母工程菌对肠道菌群的影响:(1)etpa酵母工程菌对肠道菌群多态性的影响:酿酒酵母组和etpa组的otu值在7、14、21、28d均高于空白对照组,并在第14d达到最大值,均与空白对照组差异极显著(p<0.01),但酿酒酵母组和etpa组间无显著差异(p>0.05)。灌服etec后,etpa组与灌服前无明显差异(p>0.05),且显著高于酿酒酵母组(p<0.05),极显著高于空白对照组(p<0.01)。(2)etpa酵母工程菌对肠道重要菌群的影响:酿酒酵母组和etpa组的重要菌群数量在7~28d均高于空白对照组。(1)酿酒酵母组和etpa组的类杆菌数量在第21d、28d显著高于空白对照组(p<0.05),酿酒酵母组和etpa组间无显著差异(p>0.05)。灌服etec后,etpa组与灌服前无明显差异(p>0.05),且极显著高于酿酒酵母组和空白对照组(p<0.01)。(2)酿酒酵母组和etpa组的梭菌数量在第14d增长量最大,且14d、28d时,均极显著高于空白对照组(p<0.01),酿酒酵母组和etpa组间无显著差异(p>0.05)。灌服etec后,仅有空白对照组显著高于灌服前(p<0.05),与酿酒酵母组、etpa组均无显著差异(p>0.05)。(3)酿酒酵母组和etpa组的肠球菌数量在第14d出现显著增长,于第21d,极显著高于空白对照组(p<0.01),酿酒酵母组和etpa组间无显著差异(p>0.05)。灌服etec后,etpa组与灌服前无明显差异(p>0.05),空白对照组、酿酒酵母组均显著高于灌服前(p<0.05),各组之间无显著差异(p>0.05)。(4)酿酒酵母组和etpa组的双歧杆菌数量从第7d起明显增高,于第14d,极显著高于空白对照组(p<0.01),酿酒酵母组和etpa组间无显著差异(p>0.05)。灌服etec后,etpa组与灌服前无明显差异(p>0.05),显著高于酿酒酵母组(p<0.05),极显著高于空白对照组(p<0.01)。(5)酿酒酵母组和etpa组的乳杆菌数量在第14d、21d,极显著高于空白对照组(p<0.01),酿酒酵母组和etpa组间无显著差异(p>0.05)。灌服etec后,各组均出现下降,etpa组极显著高于空白对照组和酿酒酵母菌组(p<0.01)。(3)etpa酵母工程菌对肠道菌群ph的影响:实验第7~28d,酿酒酵母组和etpa组的ph值呈下降趋势,在第21d,均显著低于空白对照组(p<0.05),酿酒酵母组和etpa组间无显著差异(p>0.05)。灌服etec后,空白对照组ph值显著升高(p<0.05),极显著高于酿酒酵母组和etpa组,酿酒酵母组和etpa组间差异显著(p<0.05)。2.etpa酵母工程菌对肠道黏膜免疫的影响:(1)etpa酵母工程菌对肠道黏膜结构的影响:(1)酿酒酵母组和etpa组的小肠各段绒毛长度在7~28d均呈增长趋势,均于第28d达到最大值,其中空肠绒毛长度极显著高于空白对照组(p<0.01),酿酒酵母组和etpa组间无显著差异(p>0.05)。灌服etec后,空白对照组和酿酒酵母组的空肠绒毛长度极显著下降(p<0.01),与etpa组差异极显著(p<0.01)。(2)酿酒酵母组和etpa组的小肠各段绒毛宽度在实验中均无显著差异(p>0.05)。(3)酿酒酵母组和etpa组的空肠隐窝深度在第28d,显著低于空白对照组(p<0.05),酿酒酵母组和etpa组间无显著差异(p>0.05)。灌服etec后,各组的空肠隐窝深度极显著升高(p<0.01),etpa组极显著低于空白对照组和酿酒酵母组(p<0.01)。(4)酿酒酵母组和etpa组空肠、回肠v/c值均在28d达到最大最,且在第28d时空肠v/c值极显著高于空白对照组(p<0.01),酿酒酵母组和etpa组间无显著差异(p>0.05)。灌服etec后,空白对照组空肠v/c值极显著下降(p<0.01),且极显著低于酿酒酵母组和etpa组(p<0.01);酿酒酵母组回肠v/c值显著下降(p<0.05),且显著低于etpa组(p<0.05)。(2)etpa酵母工程菌对肠道黏膜中siga的影响:实验第7~28d,酿酒酵母组和etpa组的siga含量呈上升趋势,于第21d达到最大值,均极显著高于空白对照组(p<0.01),酿酒酵母组和etpa组间无显著差异(p>0.05)。灌服etec后,各组均极显著下降(p<0.01),etpa组极显著高于空白对照组和酿酒酵母菌组(p<0.01)。(3)etpa酵母工程菌对肠道黏膜中重要细胞因子的影响:实验第7~28d,酿酒酵母组和etpa组的il-2、il-4、ifn-γ呈上升趋势,在第14d,il-2的相对增长倍数最大,与空白对照组差异极显著(p<0.01);从第14d起il-4、ifn-γ快速增长,在第21d、28d,均极显著高于空白对照组(p<0.01),酿酒酵母组和etpa组间无显著差异(p>0.05)。灌服etec后,空白对照组和酿酒酵母菌组的il-2、il-4、ifn-γ均极显著变化(p<0.01),il-2、il-4的含量极显著低于etpa组(P<0.01),IFN-γ的含量极显著高于EtpA组(P<0.01)。综合以上结果得到以下结论:1.Etp A酵母工程菌具有酿酒酵母的益生作用:能有效促进小肠黏膜的发育,加强肠道黏膜的吸收功能;丰富肠道菌群多态性,增加重要菌群数量;降低肠道菌群pH值;刺激肠道黏膜中重要免疫分子的分泌,加强肠道黏膜免疫功能。2.从灌服第7d起随着灌服天数的增加,小肠各段绒毛长度、V/C值逐渐增加;肠道内有益菌群及重要细胞因子在第14d大幅度增加,而后缓慢增加;SIgA在第21d分泌量极显著增加,至第28d达到最高。3.Etp A酵母工程菌发挥了大肠杆菌黏附素Etp A的免疫原性:当ETEC侵入机体时,能有效阻止ETEC的黏附,保护肠道黏膜结构的完整,维护肠道菌群的稳定,提高肠道黏膜免疫能力。